急性缺血性卒中血栓特征的研究进展2024.docx

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1、急性缺血性卒中血栓特征的研究进展2024摘要：血栓栓塞和原位血栓形成是缺血性卒中发生的最主要原因,但由于人体血栓组织获取困难,既往关于卒中血栓特征的研究较少。近年来,血管内介入技术的快速发展为研究血栓构成创造了条件。该文从病理学、免疫组织化学、组学、力学、外源性物质5个方面回顾了急性缺血性卒中血栓的构成特点,分析了这些特征在卒中诊断、分类及治疗方案制定中的价值,并探讨了这些特征对急性缺血性卒中患者行机械取栓术后神经功能预后的影响。卒中具有高发病率、高复发率、高致残率、高致死率等特点,其中缺血性卒中约占所有卒中的70%1。血栓栓塞和原位血栓形成是缺血性卒中发生的最主要原因2,但由于获取人体血栓组

2、织困难,既往关于卒中血栓特征的研究较少。近年来血管内介入技术的快速发展为研究人体血栓构成创造了条件3。相对于尸检,经机械取栓获取的血栓具有更好的时效性,能够发现血管事件发生当时的血栓结构特征。本文从病理学、免疫组织化学、组学、力学、外源性物质5个方面阐述了急性缺血性卒中(acuteischemicstroke,AlS)血栓的构成特点,分析了这些特征在卒中诊断、分类及治疗方案制定中的价值,并探讨了这些特征对AIS患者行机械取栓术后神经功能预后的影响。1血栓病理学血液流动状态下,血管内皮细胞功能失调或血管内膜发生损伤后,血管内皮下的胶原纤维暴露,激活并促使血小板聚集形成血小板团块,纤维蛋白原转变为

3、纤维蛋白,聚集的血小板附着在血管壁上,形成血小板梁结构,纤维蛋白网住白细胞和红细胞,最终凝结成块状物体,该过程即为血栓形成4。血栓形成后,血管内血流动力学发生继发性改变,血液中大量红细胞聚集在血栓起始部位,形成以红细胞为主的血栓。AIS血栓通过苏木素-伊红、马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色等病理染色后,经显微镜下观察,可分为两种类型:红细胞富集区和血小板富集区。红细胞富集区的结构特点为稀疏的纤维蛋白网络结构内聚集大量的红细胞,偶见散在分布的白细胞;血小板富集区为可见致密的纤维蛋白结构包裹血小板,并将其分割成岛屿样结构,称之为血小板梁5。大多血栓为二者的混合成分（混合血栓）,少部分血栓为富含血小板而

4、缺乏红细胞的血栓（白色血栓）,或是富含红细胞而缺乏血小板的血栓（红色血栓）5-9。目前较多研究根据血栓整体结构特点将血栓分为富含纤维蛋白及血小板的血栓和富含红细胞的血栓6,10-12oFitzgerald等13纳入441例AIS患者,采集行机械取栓术过程中每次尝试通过血栓后所得的血栓样本（共尝试612次通过取栓）,以术中尝试通过次序为分类变量第1次（352例）,第2次（142例）,第3次（56例）,第4次（29例）,第5次（33例）,计算每次尝试通过后所得血栓的面积及组成成分相对含量,结果显示,早期尝试通过后所得血栓的红细胞相对含量更高第1次:42.78%,第2次:39.06%,第3次:39.

5、64%,第4次:30.86%,第5次:35.20%;H=11.644zP=0.020,血小板相对含量更低（第1次:25.00%,第2次24.77%,第3次:26.30%,第4次:27.73%,第5次:37.43%;H=15.977zP=0.003）,提示与富含红细胞的血栓相比,富含纤维蛋白及血小板的血栓可能导致更多再通尝试次数、更长的手术时间。AIS血栓结构具有高度异质性,但也具有共同结构特征。显微镜观察结果显示AIS患者的血栓边缘通常会形成一层致密的纤维蛋白外壳,血小板、红细胞和纤维蛋白在血栓边缘高度集中，而在中心区域相对稀疏14。位于血栓边缘的红细胞被压缩成多面体形态,并且其排列具有一定的

6、取向性,靠近中心区域的红细胞则倾向于正常的双面凹形态,并且缺乏取向性,这可能是由于血栓边缘分布的活化血小板形成伪足,吸附纤维蛋白,驱动血栓收缩,最终形成外周边缘致密、内部疏松的结构特点15。这种壳-核结构可能是发生溶栓抵抗的重要原因之一12o目前,已有较多研究将血栓中主要成分相对含量的差异与卒中病因关联起来,可能由于样本量的差异及统计学方法不一致,各研究所得结论并不统一16oSporns等17纳入187例行取栓治疗的AIS患者,77例(41.2%)为心源性栓塞型卒中,35例(18.7%)为大动脉粥样硬化型卒中1例(5.9%)为其他明确病因型卒中,64例(34.2%)为隐源性卒中。通过病理组织染

7、色以及免疫荧光法标记出红细胞、白细胞及纤维蛋白,半定量分析各成分相对含量,结果显示,与非心源性栓塞型卒中患者的血栓相比,心源性栓塞型卒中患者的血栓中纤维蛋白(60.0%比51.5%?=0.027)、白细胞(8.0%比5.0%,P=0.026)占比更高,而红细胞占比较低(28.0%比42.0%,P=0.005)。进一步分析显示,隐源性卒中患者的血栓与心源性栓塞型卒中患者的血栓组织学成分比例高度相似(纤维蛋白：63.5%比60.0%,P=0.916;红细胞:26.0%比28.0%zP=0.767)。部分研究者认为膜床上病因不明的卒中有可能为潜在的心源性疾病所致,对于不能明确病因分型的AIS,通过个

8、体化分析血栓结构特点或许可协助明确病因18-19。另一项研究纳入1350例接受取栓治疗的AIS患者,267例(20%)为大动脉粥样硬化型卒中,662例(49%)为心源性栓塞型卒中,301例(22%)为隐源性卒中,其余为高凝状态或夹层。半定量分析血栓中红细胞、纤维蛋白、白细胞、血小板的相对含量,大动脉粥样硬化型卒中患者血栓中的红细胞相对含量高于心源性栓塞型卒中(4623)%比(4222)%lP=0.01及隐源性卒中(4623)%比(4124)%,P=0.02患者的血栓。在此基础上进行的受试者工作特征曲线分析未能找到可以显著区分心源性栓塞型和大动脉粥样硬化型血栓的阈值点20L该研究结果与Sporn

9、s等17的研究结果基本一致。由此可见,AIS患者不同病因分型的血栓组成在客观上具有差异性,但血栓中红细胞、血小板、纤维蛋白的相对含量差异可能更多取决于卒中当时的血管内血流动力学特点,例如大动脉粥样硬化型血栓通常在大血管狭窄的基础上有原位血栓形成,此时血流缓慢,红细胞更容易聚集成块。因此以血栓成分及其含量作为病因分型依据仍有局限性,需要结合免疫组学、蛋白组学等方法。血栓形成后,其组成成分、结构特点会发生动态变化。体积较小的新鲜血栓可能更易被纤溶酶等溶解,体积较大的血栓可仅部分区域发生软化。若血栓未能被溶解持续存在于血管中,则肉芽组织逐渐取代血栓,这一过程被称为血栓机化21基于红细胞、粒细胞含量及

10、结构特点可判断血栓形成时间22oRittersma等23首次对不同血栓形成时间的结构特征作出明确定义新鲜血栓(形成时间1d)通常由血小板、纤维蛋白、红细胞和形态完整的粒细胞组成;溶解性血栓(形成时间15d)可见凝固性坏死和粒细胞核破裂现象;陈旧性血栓(形成时间5d)可见梭形细胞生长,偶见伴有结缔组织沉积和毛细血管生长,经免疫荧光技术可见抗-平滑肌肌动蛋白抗体阳性。后续关于血栓形成时间的研究大多以此作为参考标准。在实际中,一个血栓通常是上述三种的混合体。Kitano等24观察了185例经取栓治疗AIS患者的血栓样本才安照以下标准划分血栓形成时间：(1)显微镜下见完整的粒细胞占80%以上,考虑为新

11、鲜血栓;(2)凝固性坏死或核破裂的粒细胞占20%以上时考虑为溶解性血栓;(3)可见抗-平滑肌肌动蛋白抗体阳性时,考虑为机化血栓。结果显示,经取栓治疗AIS患者的血栓以溶解性血栓71%(131185)和新鲜血栓23%(43/185)为主,机化血栓少见6%(11185)。将溶解性血栓与机化血栓归类为陈旧性血栓,与新鲜血栓比较,在病理组织学上陈旧性血栓的红细胞所占比例更小(35%比53%zP0.01)。通过限制平均生存时间分析新鲜血栓组与陈旧性血栓组患者在规定截断时间(120min)内动脉穿刺至再灌注的平均时间,结果显示,新鲜血栓组平均穿刺至再灌注时间较陈旧性血栓组短(55.9min比71.5min

12、,P=0.002),发病后90d预后不良改良Rankin量表(mRS)评分56分的患者比例较陈旧性血栓组降低了51%(调整后cOR=0.49,95%CI:0.240.99;P=0.047)o2血栓免疫组织化学免疫组织化学分析发现,AIS血栓中几乎都存在血管性血友病因子(VOnWillebrandfactor,vWF)及中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophilextracellulartrapszNETS),因此目前一般认为VWF及NETs是血栓构成的基本成分25-27。2.1vWFVWF可黏附和募集血小板,稳定凝血因子vm,从而对止血、血栓形成发挥重要作用。vWF正常分布于血浆、内皮下基质、

13、内皮细胞和血小板内的储存颗粒中,当血管内皮损伤时NWF因子从储存颗粒中释放至血液中,受到血流剪应力的作用后,vWF因子发生活化并锚定于内皮下胶原,与胶原纤维共同活化并聚集血小板28。通过免疫组织化学技术分别标记血栓中vWF、纤维蛋白、血小板,可以观察到在富含纤维蛋白的白色血栓中,vWF富集区与纤维蛋白及血小板富集区高度重合27,29。VWF因子在血栓形成过程中可能充当着激活及黏附剂的角色,可促进血小板、纤维蛋白、胞外DNA物质聚集并黏合成稳定的团块黏附在血管壁上。VWF裂解酶(adisintegrinandmetalloproteinasewithathrombospondintype1mot

14、ifmember13zADAMTS13)是一种特异性解聚vWF多聚体的蛋白酶30。越来越多证据表明，重组人源ADAMTS13(recombinanthumanADAMTSl3,rhADAMTS13)可能成为AIS溶栓治疗新药30-31。Denorme等32通过构建富含vWF血栓的小鼠AIS模型发现,阿替普酶对富含vWF成分的血栓疗效较差,对该类阿替普酶抵抗血栓在5min内使用rhADAMTS13治疗后可恢复血管再通,并且血流改善程度呈现出剂量依赖性。该实验在血管闭塞5min后给予rhADAMTS13(3500U/kg)并监测闭塞血管血流量,结果显示,闭塞血管在25min内逐渐恢复血流量并维持在

15、发病前基线血流量的75%以上,血管闭塞60min后血流量可恢复至发病前基线血流量的(76.615.9)%。由于ADAMTS13仅针对性解聚VWF多聚体,不能降解纤维蛋白,因而限制了其在其他类型血栓中的应用。vanMoorsel等33研发了一种新型靶向溶栓剂微溶酶由靶向VWF的纳米颗粒和尿激酶纤溶酶原激活剂的催化结构域组合而成;微溶酶靶向结合VWF后激活尿激酶纤溶酶原激活剂,进而活化纤溶酶原,发挥溶栓作用。该实验利用激光散斑技术测量血栓形成Wmin后小鼠脑灌注水平,该值定义为AIS小鼠模型大脑灌注基线水平。分别测量血栓形成70min后阿替普酶治疗组和微溶酶治疗组小鼠脑灌注水平,评估灌注改善率(治

16、疗前后脑灌注差值与基线水平的比值)。结果显示与安慰剂组相比,阿替普酶组(35.817.1)%比(15.67.5)%zP=0.O01及微溶酶组(39.313.1)%比(15.67.5)%,P0.01小鼠脑灌注改善率均提高提示微溶酶在AIS发病早期能够改善脑皮质灌注。该实验对推进AIS溶栓药物研发具有一定的意义,但限于目前实验样本量较少,未来还需要更多动物实验或临床研究来证实新药的有效性及安全性。2.2NETsAIS血栓中含量最丰富的白细胞亚型为中性粒细胞26。在血栓形成过程中,应激状态促使中性粒细胞活化,细胞内的核物质解聚后释放至细胞外,形成表面装饰有瓜氨酸修饰组蛋白H3和颗粒蛋白的细胞外DNA纤维网状结构,称为NETs34-35oPir等5通过免疫荧光技术详细地描述了血栓中NETS结构,利用瓜氨酸修饰组蛋白H3特异性抗体标记胞外DNA结构