《基于mRNA技术疫苗生产现场检查手册》.docx

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1、基于mRNA技术疫苗生产现场检查手册2023年910月-X-Z-=_刖三本手册由河北省药品监督管理局发起并组织编写。本手册由北京市药品监督管理局、天津市药品监督管理局、河北省药品监督管理局联合发布实施。一、目的3二、适用范围3三、法规依据3四、mRNA疫苗工艺概述4（一）mRNA疫苗基本工艺简介51、制备环状质粒52、制备线性化质粒53、mRNA疫苗原液生产64、mRNA疫苗制剂生产6（二）mRNA疫苗特点78五、mRNA疫苗生产现场检查要点8（一）机构与人员8（二）厂房设施与设备9（三）物料与产品111、菌毒种管理11122、生产用原辅料管理13（四）确认与验证14（五）文件管理15（六）生

2、产管理161、菌种复苏162、发酵和收获菌泥173、碱裂解及纯化174、质粒线性化185、体外转录（IVT）18196、LNP-mRNA制备19207、层析纯化分离208、超滤219、半成品配制2210、分装、轧盖、灯检2311、储存和运输2412、生产管理检查要点还应包括但不限于25（七）质量控制和质量保证261、实验室管理262、质量控制情况273、数据管理情况284、偏差管理情况295、变更管理情况296、产品质量回顾情况30（八）委托管理情况3031（九）药物警戒管理情况311、机构及人员管理312、质量体系管理313、监测与报告管理31324、风险管理32（十）技术转移32一、目的为

3、指导检查员对基于mRNA技术疫苗（以下简称mRNA疫苗）生产企业开展生产现场检查，保障mRNA疫苗生产过程稳定可控、产品质量安全有效，以风险控制为目的，以药品管理法疫苗管理法及相关法规为依据，制定本检查手册，作为mRNA疫苗生产现场检查基础性技术指导文件，提升mRNA疫苗检查过程中风险识别能力。检查员可参照本手册的要求，对企业的生产和质量管理进行检查。二、适用范围本手册所称mRNA疫苗系指将外源目的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞并表达目的蛋白、刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。本手册适用于北京市、天津市、河北省内mRN

4、A疫苗的GMP检查，包括从生产用菌毒种管理、原辅材料管理、质粒制备、质粒贮存及运输、脂质体包裹、原液生产、制剂生产、产品质量控制、成品入库及留样全过程。三、法规依据1 .中华人民共和国药品管理法2 .中华人民共和国疫苗管理法3 .中华人民共和国生物安全法4 .中华人民共和国药品管理法实施条例5 .疫苗流通和预防接种管理条例6 .病原微生物实验室生物安全管理条例7 .医疗废物管理条例8 .药品生产监督管理办法9 .药品注册管理办法10 .药品生产质量管理规范及其附录11 .生物制品批签发管理办法12 .药品记录与数据管理要求（试行）13 .药品召回管理办法14 .疫苗生产流通管理规定15 .药品

5、上市后变更管理办法16 .疫苗储存和运输管理规范17 .药品说明书和标签管理规定18 .药品注册现场核查管理规定19 .药品不良反应报告和监测管理办法20 .药品生产企业现场检查风险评定原则21 .食品药品监管总局国家卫生计生委关于进一步加强疫苗流通监管促进疫苗供应工作的通知（食药监药化监201776号）22 .国家药监局关于进一步加强疫苗生产企业派驻检查工作的通知（国药监药管202315号）23 .河北省药品上市后变更管理办法实施意见（试行）24 .已上市生物制品药学变更研究技术指导原则（试行）25 .新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）26 .药品共线生产质量风险管理

6、指南四、mRNA疫苗工艺概述mRNA疫苗是将外源目的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞并表达目的蛋白、刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。由于企业产品管线差异，产品工艺步骤可能会有所不同，mRNA疫苗生产一般包括转录模板质粒种子库的建立和检定、原液生产、制剂生产、质量检验等过程。其中，原液生产包括模板生产和mRNA制备，涉及种子复苏、扩增、规模培养、菌泥收集、菌泥裂解、澄清过滤、质粒纯化、质粒线性化、模板纯化、转录反应（可能包含加帽及加尾反应）和mRNA纯化等工序。制剂生产包括mRNA疫苗半成品配制、灌装（可能包含冻干）和包

7、装。（一）mRNA疫苗基本工艺简介以利用大肠杆菌（E.coli）扩增目的基因模板工艺为例，mRNA疫苗生产工艺大致为：1.制备环状质粒：将含目的DNA序列的质粒的菌种复苏后，经摇瓶，种子罐和发酵罐扩增培养，离心收获菌泥。将发酵收获的菌体，经过碱裂解、过滤、凝胶层析去除RNA和宿主残留蛋白等相对较小的杂质、亲和层析去除开环质粒、阴离子交换层析去除内毒素、过滤除菌得到环状质粒中间体。大致步骤举例如下：仲f复昴IT一缎种夕格界ITl二肿广培KlTl发的培诈IT离心IlftIi环状质敕中阿体%I除得过1gtttft-【乐析纯化卜It丽正1图1:环状质粒制备流程图2,制备线性化质粒：将环状质粒中间体经过

8、酶切、离子交换层析、超滤浓缩换液、除菌过滤分装，得线性化质粒中间体，最后分装冻存。大致步骤举例如下：lwmttMHMWIT阴离子层析I-Ii三IT除命过墟I三tftw图2：线性化质粒制备流程图3mRNA疫苗原液生产：以线性化质粒中间体为模板，经IVT反应及纯化工艺后制得mRNA原液。IVT反应体系通常采用含有核昔酸三磷酸底物、聚合酶辅因子、含有多胺和抗氧化剂的PH缓冲液，通过RNA聚合酶催化，以前工序制备的DNA为模板来合成目标mRNAo转录后的mRNA需要经过一系列修饰才能构成完整分子，在5,端形成一个CaP结构，在3，端形成PoIyA尾结构。cap结构和PolyA尾结构可以抑制mRNA被降

9、解，同时增强翻译效率。在体外转录过程中可以将合成好的5,CaP结构添加到特定的转录起始序列，直接转录出具有天然CaPl结构的mRNA。mRNA的加帽工艺有共转录加帽和转录后加帽2种选择。共转录加帽是通过向IVT反应体系中加入7-甲基鸟喋吟二核昔酸、抗反向帽类似物或三核甘酸帽类似物在反应过程中向mRNA的5,端添加Cap结构。转录后加帽是在IVT反应结束后使用牛痘加帽酶反应体系对mRNA进行加帽。以共转录加帽为例-,大敌工艺步骤加EII,I雇祚i匕而粒HI5克应ZH模板去除离广大换了析纯化I原液分装I-I除菌过流IITFF缓柒液置正图3：原液制备流程图mRNA疫苗原液生产流程图4mRNA疫苗制剂

10、生产mRNA疫苗需要穿过细胞膜进入细胞质被翻译成蛋白质而发挥其免疫作用，但mRNA是带负电荷的亲水性大分子，其自主跨膜能力有限且易被体内RNaSe降解。当前有多种方式用于mRNA的递送，如电穿孔法、鱼精蛋白、树状聚合物、阳离子胶束和纳米脂质颗粒（LNP）等，其中LNP是目前最热门的递送技术。LNP的制备方法有挤出法、薄膜水化法、高压均质法、微流控技术等，其中微流控技术应用最为广泛。1.NP在包封时利用微流控技术让含mRNA水相和脂质体有机相按照一定的比例和流速混合，得到LNP-mRNA颗粒。包封后的LNP-mRNA经透析浓缩、过滤等步骤去除细菌、裸mRNA、空载LNP和乙醇等物质，再调节pH,

11、获得mRNA制剂原液。mRNA制剂原液按照无菌注射剂产品分装要求进行灌装，从而得到了用于人体的mRNA疫苗。以LNP-mRNA工艺为例，大致生产步骤如下：入底五金卜灯检注，I；净变：lI:：如都i俵交颗I的区II；吸画图4：mRNA疫苗制剂生产流程图（二）mRNA疫苗特点开发速度快是mRNA疫苗技术最显著的优势。通过研究病原体的基因序列，可以快速地锁定潜在抗原编码片段，将其序列融入DNA模板并以此合成相应的mRNA后，加以脂质纳米包封形成疫苗制剂即可递送至人体。同时，mRNA技术具备一定的通用性，理论上可以利用相似过程开发各类所需要的疫苗。此外，mRNA疫苗还具有以下特点：（1）能导入细胞，在

12、体内表达相应的抗原蛋白，减少了体外蛋白表达、纯化过程；（2）能够刺激免疫系统产生体液免疫和/或细胞免疫应答，发挥相应的免疫预防和/或免疫治疗作用；（3）其递送系统具有类似佐剂的部分特性，能够通过刺激机体免疫系统产生多种细胞因子等方式增强机体免疫反应能力或改变免疫应答类型；（4）由于mRNA的降解是通过细胞正常代谢完成，降低了因感染或整合诱发基因突变的潜在风险。尽管mRNA疫苗具有多重优势，但尚存在诸多风险因素，如mRNA本身具有的潜在免疫原性、递送系统（如脂质纳米颗粒）的稳定性、纳米剂型安全性及所使用阳离子聚合物/脂质体安全性、递送靶向性及递送效力等问题，都会影响疫苗的有效性、安全性和质量可控

13、性，也是我们在生产现场检查中需要重点关注的问题。五、mRNA疫苗生产现场检查要点（一）机构与人员企业应当建立与药品生产相适应的管理机构，并配备足够的、符合要求的人员，为实现质量目标提供必要的基础条件。检查要点包括但不限于：1.机构设置和人员配备、培训情况：所有人员应当明确并理解自己的职责，熟悉与其职责相关的要求，并接受必要的培训，培训与所生产品种工艺及岗位操作是否具有针对性，培训的内容能否与岗位的要求相适应；2 .疫苗生产企业关键人员的资质和实际履行职责情况：生产管理负责人、质量管理负责人和质量受权人是否具有相应的专业知识（微生物学、生物学、免疫学、生物化学、生物制品学等），是否能够在生产、质

14、量管理中履行职责；3 .关键岗位操作人员如无菌操作岗位操作和记录的规范性情况，关键岗位人员转岗程序和培训情况。(二)厂房、设施与设备厂房和设备的设计、布局、维护等需符合既定用途，应当能够最大限度地避免污染、交叉污染、混淆和差错，便于清洁、操作和维护。检查要点包括但不限于：1.原液生产厂房设置能否避免污染与交叉污染：生产环境的空气洁净度级别是否与生产操作相适应，生产过程应采取密闭系统操作，如不可避免时应采取措施防止微生物、病毒、粒子的扩散及污染；其菌种复苏、扩增、培养、纯化过程应符合中华人民共和国生物安全法药品生产质量管理规范(2010年修订)及生物制品附录相关要求；2 .共线生产管理应符合中国

15、药典药品生产质量管理规范及其附录中的相关规定。(1)由于生物制品的复杂性，对于共线生产品种应进行充分的风险评估，评估内容应包括人流和物流、微生物控制、活性物质的理化特性、工艺特点、清洁工艺、环境监测、控制策略、残留成分限度检测能力等；(2)关注防止交叉污染的措施(例如采用阶段式生产、封闭系统、直接接触产品的生产工具按品种专用、一次性使用系统等)；如使用传统的生产系统进行多产品共线生产，应使用经验证的密闭设备、空间消毒、表面消毒、在线清洁和灭菌及气流保护等措施，避免产品的交叉污染；(3)如涉及相同类型产品共线生产，在每一种质粒生产结束后，应当采取有效的方式对生产设备进行灭活和清洁。同时考虑对可能残留有质粒的生产区域进行灭活（如空间熏蒸）和清洁，基于质粒的稳定性，应当采用多种组合的方式进行灭活和清洁，并考虑开发合适的采样及检测方法对质粒的去除效果进