具有不对称膜囊泡用于高效多肽药物的释放分析研究 功能材料专业.docx

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1、目录摘要11 .前言21.1 引言21.2 聚合物囊泡的组成31.3 聚合物囊泡的制备方法和载药机理41.4 课题提出42 .实验部分52.1 材料与试剂52.2 仪器与表征62.3 聚合物囊泡包载LTX-315(PS-LTX-315)制备条件的筛选62.3.1 制备纳米粒与静置交联时的转速筛选62.3.2 溶液PH的筛选62.3.3 理论载药量的筛选72.3.4 纳米粒在FBS条件下的稳定性和稀释稳定性(纳米粒浓度是20ugml)以及GSH条件下的响应性72.3.5 A6修饰包载LTX-315囊泡（A6-PS-LTX-315）的制备82.4 细胞毒性实验（MTT实验）83 .结果与讨论83.

2、1 聚合物囊泡包载多肽药LTX-315的制备条件的筛选93.1.1 制备纳米粒以及摇床中静置交联转速的筛选93.1.2 溶液PH的筛选113.1.3 理论载药量的筛选143.1.4 纳米粒在FBS条件下的稳定性和稀释稳定性（纳米粒浓度是20ugml）以及GSH条件下的响应性153.1.5 A6修饰的载LTX-315的囊泡（A6-PS-LTX-315）的制备173.2A6-PS-LTX-315的细胞毒性实验（MTT实验）184 .结论19参考文献21致谢错误!未定义书签。具有不对称膜囊泡用于高效装载多肽药物摘要生物药物相比化疗药物具有更低的毒副作用和广阔的发展前景。但这类药物容易被蛋白酶降解，生

3、物利用率降低，肿瘤的穿透能力也差，使其发展受到阻碍。为了解决这个问题，我们基于实验室所特有的DTC平台技术，设计了具有不对称膜结构的囊泡mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10,该囊泡亲水内膜由带负电的天冬氨酸组成。通过溶液置换法制备得到载阳离子抗菌肽LTX-315的囊泡。为了增强纳米囊泡的肿瘤特异性，我们在PEG的末端修饰了靶向配体A6,从而形成高效装载多肽药物的自交联稳定的靶向囊泡。本文研究了溶液pH、搅拌转速、理论载药量以及靶向聚合物配比等条件对药物包载的影响，针对多肽药物的载药量、囊泡粒径及其分布情况筛选出最佳条件。止匕外，MTT实验结果表明，A6修饰的载药囊泡比无靶向囊泡在杀死

4、B16F10黑色素瘤细胞上表现出更优异的杀伤效果。关键词：不对称膜囊泡；阳离子抗菌肽；LTX-315；细胞毒性AbstractBiologicaldrugsareadvantageouscomparedtochemodrugsowingtotheirlowsideeffectsandhighspecificity,showinghighpotentialforcancertherapy.However,thesedrugscanbeeasilydegradedbyenzymesinvivo,havepoorpenetrationabilityandlowbioavailability,whic

5、hhindertheirfurtherdevelopment.Inordertosolvetheproblems,basedonDTCtechnologyplatformwedesignedandSynthetizedchimaericpolymersomesfromcopolymerPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10,inwhichnegativelychargedpolyasparticacidformstheinnershell.Duringtheformationofpolymersomes,cationicantimicrobialpeptideLTX-315wasenca

6、psulatedinsidethepolymersomes.Toenhancetumorspecificity,tumortargetingligandA6peptidewasanchoredonthepolymersomesurfacetoformLTX-315loaded,self-crosslinkedstablepolymersomes.Inthisthesis,theeffectofpH,agitationspeed,drugloadinginfeedandtargetingpolymercontentonthefinaldrugloadingcontent(DLC)wasstudi

7、ed.ThebestconditionswerescreenedoutforDLC,sizeanddistributionofpolymersomes.Inaddition,MTTassayresultsdisplayedthatA6modifiedLTX-315loadedpolymersomesshowedsuperiorcytotoxicityonB16F10melanomacellstonon-targetedpolymersomes.Keywords:Chimearicpolymersomes,Cationicantimicrobialpeptide,LTX-315,Cytotoxi

8、city1 .前言1.1 引言近年来,恶性肿瘤对人类的威胁日趋严峻,对社会经济也产生巨大的影响。手术、放疗与化疗是现阶段临床上治疗癌症的主要方法。化疗药物虽应用广泛，能有效抑制肿瘤细胞的生长，却无法选择性识别肿瘤细胞与正常细胞，产生较强的毒副作用。此外，在治疗过程中肿瘤细胞产生耐药性，也会大大限制了化疗药物在癌症治疗中的作用。相比于传统的化疗药物，生物药物如蛋白质、核酸、多肽药物等因其具有更低的毒副作用等优点，受到研究者的青睐，多肽药物与其他的生物药相比，其结构简单,合成技术简便。目前研究发现，许多生物阳离子活性肽(ACPS)具有抗癌活性，它们通过静电作用与癌细胞膜相互作用或通过与细胞内靶的相

9、互作用杀死癌细胞。在这些生物活性肽中，LTX-315(CKKWWKKW(DiP)K-NH2)一种9肽阳离子溶瘤肽表现出良好的抗癌活性和肿瘤治疗能力，它可以刺激抗癌免疫应答，逆转癌细胞的耐药性。它有潜力作为一种新型的抗癌药物，而且目前正在处于临床的I期11期研究。然而多肽药物在体内很容易被生物蛋白酶降解，生物利用率比较低，肿瘤的穿透能力也比较差。为了克服这些缺点，使多肽药物得到更好的应用，纳米药物载体的优越性能受到越来越多的关注与研究o纳米药物载体包括聚合物胶束、脂质体、纳米凝胶、聚合物囊泡等。这些纳米药物载体的粒径通常在20-200nm,这使得它们可以利用EPR效应，有效地将抗癌药物定向输送到

10、癌症细胞。抗癌药物因此被动地富集在肿瘤组织中，并大大减小了毒副作用，降低对正常细胞的伤害。迄今为止，12种纳米药物已经在临床中投入使用，止匕外有1000多种纳米药物也正处于临床试验的不同阶段。二十世纪后期，AdiEisenberg和DennisDischer教授研究并提出了聚合物囊泡的结构，引发了人们对聚合物囊泡进行了大量研究。尤其是它作为纳米药物载体的巨大潜力，正受到越来越多的关注。聚合物囊泡由两亲性聚合物在水溶液中自组装形成，较于脂质体拥有更好的稳定性和机械性能，其亲水内腔适用于包裹各种亲水性药物。止匕外，聚合物的多样性赋予了囊泡结构不同的性能，例如生物可降解性、刺激响应性以及体内循环稳定

11、性等口叫在囊泡表面修饰上肿瘤细胞特异性的靶向分子，可以使其在体内循环时，通过配体-受体介导进入靶向部位，于肿瘤组织中特异性聚集并释放抗癌药物，从而达到靶向治疗的目的，减小对正常器官的伤害。目前，全球范围的研究者们已经在聚合物囊泡应用于纳米药物方面取得了丰硕的成果，针对不同的需求，开发出了刺激响应性囊泡、肿瘤主动靶向囊泡、循环稳定的囊泡、生物可降解囊泡、具有不对称膜型囊泡等众多功能性囊泡，为囊泡纳米药物的临床发展奠定了基础。1.2 聚合物囊泡的组成结合LTX-315的亲水性和带正电的性质，我们选取了聚合物囊泡作为这次毕业设计所用的纳米载体。聚合物囊泡是由两亲性的聚合物在水溶液中自组装而成的纳米粒

12、子，它具有可以包裹疏水药物的疏水的双分子膜层，和可以包载亲水药物的内腔。调节聚合物亲疏水链段的比例可形成不同结构的自组装体,例如薄层结构、棒型胶束、球型胶束、管型囊泡和球型囊泡等。通常情况下，当聚合物亲水段占总分子量的20%40%时，聚合物倾向于自组装形成囊泡结构。不对称膜囊泡区别于一般的囊泡结构，它的内外壳由不同的两亲性聚合物组成,较长的亲水链倾向于排列在囊泡的外壳,而较短的亲水链倾向于排列在囊泡的内壳。利用这种特殊结构，我们可以控制聚合物性质和分子量来提高囊泡的载药能力。在本论文中，基于我们课题组特有的DTC平台技术载体，我们选用了内膜由天冬氨酸修饰的聚合物载体来自组装成一种不对称膜囊泡，

13、利用它带负电的性质包载LTX-315。1.3 聚合物囊泡的制备方法和载药机理实验室制备聚合物囊泡的主要方法有溶剂置换法、溶剂挥发法、电形成法、薄膜水化法和直接溶解法口”而最常用的方法是溶液置换法：先将聚合物溶于良溶剂中，例如DMF、DMSO；然后将聚合物溶液加入水相中，使两亲性的聚合物自发地组装成囊泡；最后利用透析等方法将溶解聚合物的溶剂和未包载进囊泡中的自由药除去。聚合物囊泡载药方法的选择需要结合聚合物的性质，所包载的药物的性质以及溶剂等外在条件。当囊泡包载疏水药物时，一般会利用疏水膜通过疏水相互作用将药物进行包载，例如我们课题组报道过的PEG-P(DTC-CL)聚合物包载紫杉醇。而囊泡包载

14、亲水药物时，主要利用离子梯度法或静电作用等。多肽药物或带有痰基或氨基的小分子抗癌药物可以利用静电或氢键作用包载在囊泡中。而不对称膜囊泡结构对这类药物的包载效果具有优异的特点，它不仅仅能提高这类药物的载药量，还能保护药物免被机体过早清除H1我们课题组曾报道过这类囊泡Peg-P(TMC-DTC)-PEI对培美曲塞二钠(PEM)高效包载并产生了优异的抗肿瘤活性。1.4 课题提出聚合物囊泡因其可控的聚合物性质与分子量，能产生更厚的疏水膜，可稳定地装载亲水或疏水药物，延长体内循环时间，在肿瘤药物的控制释放上具有巨大的潜力。但在实际应用时，囊泡的细胞选择性差、包载率低、聚合物的生物不可降解以及囊泡在人体血

15、液循环中的不稳定等问题限制了囊泡纳米药物进入临床试验。因此，制备更为优质稳定的囊泡是本次设计的目标。我们选取聚合物mPEG-P(TMC-Co-DTC)-KDlo来制备囊泡，在囊泡结构中，PEG链段位于囊泡的外表面，凭借其链柔顺性、优异的生物可适性以及细胞和蛋白不易吸附等特点，大大延长了囊泡在生命体内循环的时间。而在完全可生物降解的疏水段PTMC中引入含有二硫戊环的DTC,可使得聚合物载体自交联形成稳定囊泡并保持其在血液循环中的稳定性，在到达肿瘤部位后在肿瘤细胞内GSH作用下能够快速响应并释放药物。最后由有天冬氨酸修饰的内膜具有负电的载体可以通过静电作用与带有正电的LTX-315多肽药很好地作用

16、在一起，稳定地对这种阳离子活性肽进行包载。2 .实验部分2.1 材料与试剂所用聚合物mPEG-P(TMC-ra-DTC)-KD10,A6-PEG-P(TMC-co-DTC)由周程师兄提供；LTX-315(98.49%,强耀生物)；谷胱甘肽(GSH,99%,Roche)；N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(99%,阿拉丁)；以下试剂均从上海国药有限公司购买后直接使用：二甲亚碉(DMSO),N9N-X甲基甲酰胺(DMF),二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4IH2O),十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4i2H2O),氢氧化钠(NaOH),透析袋(MWeo:3500Da,Spectrum),3-(4,5-二甲基曝噗-2)-2,5-二苯基四氮噗澳盐(MTT,Sigma)o2.2 仪器与表征囊泡粒径和粒径分布