重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略.docx

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1、重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略摘要大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素，并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤，总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大

2、肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。关键词：大肠杆菌表达体系；重组异源蛋白质；可溶性表达；包涵体；糖基化大肠杆菌因其培养条件简单、培养周期短、易于高密度发酵、重组蛋白质表达水平极高和极低培养成本等诸多特点而被广泛用作重组蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。尽管大肠杆菌表达体系有许多优点，但是在实际应用中也仍然存在一些不足之处，主要包括：(1)缺乏翻译后修饰。相较于真核表达体系，原核表达系统最大的局限性之一在于其缺乏类似于真核生物翻译后修饰的能力，如糖基化修饰、二硫键氧化形成等。这些修饰与重组蛋白质的可溶性、

3、稳定性及生物活性密切有关。(2)无辅助蛋白质折叠机制。原核表达体系缺乏辅助蛋白质折叠机制，重组蛋白质在原核表达体系表达过程中通常以一种自发折叠的方式形成特定结构，对于部分结构复杂、疏水性强的蛋白质易于导致错误折叠，最终形成无活性的包涵体(IBS)。据估计，大约只有30%异源蛋白质可以在大肠杆菌中以可溶性形式表达，其余以包涵体的不溶性聚集物表达，或在细胞提取物中无法检测到，是蛋白质生产和纯化过程中不可忽视的瓶颈，所以通过优化表达策略，改善异源蛋白质在原核表达体系中的可溶性表达也是目前研究的焦点。可溶性和功能性蛋白质的制备获取是生物工业应用的主要目标之一，自然途径难以获得令人满意的产量，通过具有成

4、本效益和易于扩展的原核表达体系生产可溶性和功能性蛋白质是当今功能性蛋白质获取的主要方式，尤其是在以成本控制为导向的新型合成生物学领域的应用。因此，通过选择最优表达宿主体系和最适培养生长工艺进行开发和优化目的基因表达，以最大程度减少不溶性蛋白质的生成尤其关键。尽管重组蛋白质高效、低成本表达或制备获取在学术和工业领域已经取得了系列重大成就，但利用原核表达体系进行可溶性和功能性目的蛋白质表达的需求仍未得到满足，特别是近年合成生物学技术的快速进步对低成本获取功能性重组蛋白质提出了更高需求。在过去数十年，各种生物技术的进步极大丰富了通过原核表达体系制备重组蛋白质的手段。特别是近年来，大肠杆菌底盘细胞的工

5、程化改造进展进一步拓展了原核表达体系在表达重组蛋白质中的应用。因此，本文针对现有以大肠杆菌宿主为主要代表的原核表达体系中的可溶性表达策略以及近年不断涌现出的新生物技术进展进行综述。1、 重组蛋白质在大肠杆菌中不可溶性表达（包涵体形成）的机制1.1 自身氨基酸组成重组蛋白质氨基酸组成中含硫氨基酸及脯氨酸的数量和比例能够显著影响重组蛋白质在大肠杆菌中的表达形式，含量越高，重组蛋白质更容易形成包涵体2。（1）含硫氨基酸:半胱氨酸在蛋白质结构中多以二硫键形式存在，对蛋白质分子空间结构的构象形成和稳定起着重要作用，是影响蛋白质可溶的重要因素。在大肠杆菌胞质中表达的重组蛋白质，受胞内高度还原性环境影响，二

6、硫键难以形成或稳定性下降，使重组蛋白质的结构稳定性下降，呈现聚集倾向。（2）脯氨酸:脯氨酸是组成天然蛋白质中唯一具有特殊环状结构的氨基酸，其特殊的结构对肽链二级结构起着极大程度限制作用，可赋予蛋白质特殊的空间结构和生物学特性，其结构的特殊性是很多蛋白质折叠与去折叠过程的限速步骤。1. 2亲疏水性强弱从本质上讲，蛋白质的折叠过程在一定程度上是由疏水相互作用驱动的，同时蛋白质的聚集过程极大程度是分子间疏水作用的结果。蛋白质分子内疏水结构之间的相互作用促成蛋白质疏水结构有序埋藏于蛋白质内部，亲水结构暴露于蛋白质表面，形成具备特定形状的稳定结构。蛋白质分子间通过尚未内埋的疏水区域相互作用，导致蛋白质聚

7、集。分子内和分子间的疏水作用存在一定竞争关系与相互平衡。蛋白质自身亲疏水性的强弱极大程度上决定了这两种疏水作用的平衡关系。蛋白质自身疏水性越强，分子间更容易因疏水作用引发聚集，使蛋白质错误折叠的概率越大。1.3 蛋白质合成速度与真核表达系统不同，大肠杆菌的转录和翻译是快速且紧密耦合的，而快速的蛋白质合成速度对具有复杂结构蛋白质的折叠却是致命的。在大肠杆菌胞内局部蛋白质浓度高达300400mgmL,单一重组蛋白质在大肠杆菌诱导表达末期的胞内浓度可高达近100mgmL,在超强启动子作用下，重组蛋白质合成速度比真核表达系统与哺乳动物细胞表达系统快10100倍。极其快速的合成速度以及极高同质蛋白质浓度

8、对蛋白质正确折叠带来极大挑战。由于许多真核生物蛋白质需要更长时间和/或折叠伴侣的帮助才能折叠成它们的天然状态，蛋白质合成速率提高一方面通常会导致没有足够时间进行正确的结构折叠，另一方面蛋白质过快合成使重组蛋白质折叠前体快速积累，致使缺乏足够的折叠空间，极大程度上增加了重组蛋白质之间的相互作用,形成蛋白质聚核，促使并加速更多蛋白质聚集，聚集部分折叠、未折叠或错误折叠的不溶性蛋白质。1.4 重组蛋白质分子大小及结构复杂程度大肠杆菌的平均蛋白质长度为317个残基，而人类的平均蛋白质长度为510个残基。重组蛋白质分子越大，结构往往越复杂，其所涉及的结构域通常越多，在蛋白质折叠过程中需要克服的分子势能壁

9、垒质自身结构、氨基酸组成、亲疏水性及二硫键数量等，客观性因素包括表达场所、分子伴侣（融合/非融合）、宿主类型、诱导策略、载体类型等。改善或提高重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达的策略主要针对以上主客观因素进行优化。主观性因素结构类型亲疏水性结构复杂性契基酸组成j二破该数量,奈*-表达场所“-载体类型诱导策略也始宿主类嬖分子伴倡客观性因索图2影响重组蛋白质包涵体形成的因素2.1 密码子偏好性优化参与蛋白质翻译过程中氨基酸识别与转运的密码子组成具有简并性和物种偏好性。在不同物种中，由于不同同工tRNA丰度存在差异，同义密码子在蛋白质翻译过程中的使用频率并不一致，特定物种使用某种对应同义密码子具有

10、显著倾向性。大肠杆菌表达体系稀有密码子包括AGA、AGG、AUA、CCG、CCT、CTCCGA和GTC等。密码子偏好性对重组蛋白质在大肠杆菌表达体系中的表达有着直接影响，蛋白质的正确折叠依赖于基因的顺畅表达，如含有大量单个稀有密码子或少量串列稀有密码子的目的基因在大肠杆菌中更容易出现翻译限速，甚至停滞的现象，导致蛋白质折叠错误。大肠杆菌中可用的同工tRNA的丰度与密码子之间存在着正相关性，这种关系有助于优化翻译系统,且能够平衡密码子浓度与受体tRNA浓度，提高翻译效率。因此，重组蛋白质目的基因密码子的偏好性优化对提高重组蛋白质在大肠杆菌表达体系中的高水平表达具有重要意义。有研究表明，将mRNA

11、缓慢翻译的区域段用小于或等于天然供体密码子的同义密码子进行编码，最终使异源蛋白质的表达含量提高了41000倍。常见的优化工具包括CodonWizardGeneOptimizer、SyntheticGeneDesigner等软件或网站。此外，密码子优化还在mRNA的二级结构分析和优化等方面有着重要应用。2.2 重组蛋白质诱导表达温度优化温度对大肠杆菌生长、质粒稳定性、重组蛋白质表达速度及蛋白质折叠效率等有显著影响。大肠杆菌的最佳培养温度一般为37,此温度可能并不总是有利于目的基因在大肠杆菌中表达。对于某些蛋白质，在37。C下其溶解度会显著降低，易形成聚集体，降低可溶蛋白质的表达比例。蛋白质聚集主

12、要由溶剂暴露的疏水性结构之间的相互作用驱动，疏水作用对温度的依赖性决定了聚集速度，因此过高温度会加速蛋白质间的聚集程度。同时，较高温度对细胞新陈代谢有明显加速效应，适当升高温度，可显著加速重组蛋白质质的合成速度，而合成速度的加快进一步增加蛋白质折叠前体浓度的累积，增加蛋白质正确折叠的压力。在较低温度下，细菌生命代谢速度减慢，降低转录、翻译速度，较慢的翻译速率有利于蛋白质正确折叠，同时温度降低时聚集作用也得以减弱，有利于蛋白质折叠和提高重组蛋白质可溶性表达比例。值得注意的是，较低温度也会降低最终生物量，由于蛋白质合成率降低，需要更长的诱导时间才能获得理想的蛋白质产量。例如，将重组人角质细胞生长因

13、子(KGF)的诱导温度从37降为23后，虽然KGF蛋白的表达量显著降低，但是可溶性KGF蛋白的比例得以显著提高，接近IO0%。2.3 3表达载体选择与优化表达载体通常包括复制子、筛选标记基因、启动子及转录终止子等元件，大肠杆菌的常用表达载体包括pET系列、pCold系列、pBV系列和pGEX系列等。不同载体之间包含的元件类型和数量具有明显差异。载体的启动子类型对目的基因表达水平和表达方式(可溶或不可溶)的影响非常显著。选择载体首先要考虑启动子的启动效率要足够强大，使目的基因的表达产物能够占据菌体总蛋白质的10%30%。常见大肠杆菌表达体系的启动子类型包括来源于细菌的lac、tac、trp.ar

14、aBAD启动子，以及来源于噬菌体的T7、T5、SP6启动子。pET表达载体因其具有T7强启动子而获得较高表达量，是最常使用的启动子类型。T7启动子由T7RNA聚合酶驱动，其转录DNA的速度比细菌RNA聚合酶快近5倍，但这种强大的启动转录效率会导致目的蛋白折叠前体快速累积，会增强包涵体的形成概率。其他启动效率相对较弱的启动子还包括pQE30a载体的T5启动子，pMAL-C2X载体的Tac启动子，以及PBV载体的pR/pL启动子等。较弱启动子在启动转录和蛋白质翻译过程中，目的蛋白的表达强度相对平缓，降低重组蛋白质折叠前体的累积效应，能够在一定程度上改善可溶性表达情况。对比不同表达载体，发现利用pB

15、V220质粒可在原核表达体系中成功实现无融合标签的重组rhFTL胞内可溶性表达，且能形成正确rhFTL蛋白自组装颗粒。2.4诱导策略及优化2.4.1IPTG诱导异丙基B-十1-硫代毗喃半乳糖昔(IPTG)是原核表达体系最常用的重组蛋白质表达诱导剂之一。在大肠杆菌表达系统中，乳糖操纵子表达系统最为常见。在没有乳糖存在时，Iac操纵子处于阻遏状态,转录受到抑制。当有乳糖存在时，IaC操纵子即可被诱导。IPTG是一种不可代谢的异乳糖结构类似物，通过结合Iac阻遏物，使下游插入的目的基因得以启动转录。因其不可被降解，所以诱导效率极高。IPTG的工作浓度通常在0.11mmol/L。一方面，IPTG竞争性

16、地与阻遏蛋白结合从而启动目的蛋白的转录，过高浓度IPTG会极大程度启动转录与蛋白质翻译，导致翻译后重组蛋白质折叠前体的过度累积，促进包涵体(IB)形成。另一方面，若IPTG浓度过低则达不到与IaC阻遏蛋白结合的有效浓度，从而影响蛋白质产量。根据我们实验室的经验，目前绝大多数情况都存在IPTG使用过量的情况，我们发现在实验室摇瓶培养中，当IPTG使用浓度高于10molL时，在4h的诱导周期内，重组蛋白质表达水平并无明显差异，而IPTG在10molL,重组蛋白质的表达水平与IPTG浓度才呈现较好的依赖性（结果尚未发表）。因此通过调节IPTG浓度来调控重组蛋白质的表达速度，促进蛋白质可溶性表达，建议在10UnIOl/L以下浓度范围内优化。2.4.2自动诱导在大肠杆菌乳糖操纵子表达系统中，自动诱导表达策略也是常见的诱导方式。自动诱导培养基中含有成比例的葡萄糖和乳糖，大肠杆菌会