DB51_T 3184-2024 医用供体猪 基因鉴定通则.docx

《DB51_T 3184-2024 医用供体猪 基因鉴定通则.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB51_T 3184-2024 医用供体猪 基因鉴定通则.docx（16页珍藏版）》请在优知文库上搜索。

1、ICS07.080CCSA40U!川省地方标准DB51/T31842024医用供体猪基因鉴定通则20240719发布2021608蛾四川省市场监督管理局发布DB51本文件按照GB,，T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则8的规定起草.谙注做本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不汽也识制专利的贵住。本文件由四川省经济和信息化厅提出、白口并解择.木文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、成都中科奥格生物科技有限公司、四川省医学科学院四川省人民医院、四川泰康医院、南京医科大学附叔苏州医院、海南医学院第二酊制医院、华中科技大学同济医学院附划同济医院、空军军医大

2、学第一附属医院、成部达硬实枝动物自限公司、成都爱莉眼科医院、四川行机械研究设计院（集团）育限公司、四川省实股动物学会医用旅专业委员会。本文件主要起荒人：冏李华、潘登科、马明侠、邢向阳、陈璐邓绍平、王佳梅、李艇远、张玉兰、王毅、杜嘉祥、陈凰、蒋子敬、炎科峰、杨恒铉、钟浩、姚晓明、庄项、其为。医用供体猪基因鳖定通则1本文件规定了医用供体猪翦因签定的总体原则及鉴定方法.本文件适用于医用供体猪的生产、引种、交付过程中基因界定。基因修饰动物的基因盥定可参考本文件.2 范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中.注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日

3、期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改总）适用于本文件.GB/T30989高通地基因测序技术规程GB/T33681.1高通量基因测序样本预处理方法第1部分：动物组织样本Bi处理GB35537裔通埴域因测序结果评价要求GB/T38177基因表达的测定蛋白印迹法3 *WW下列术喷和定义适用于本文件.3.1EEff1.供体Itedica1.donorpigs通过生物工程技术获得，用于提供医疗用途的活器官或生物材料制备的低免疫原性猪及其群体，3.2SSWWgeneticmodification利用生物化学方法惬改生物遗传物质，使生物产生新性状，修饰Zf式主要包括转基因、暴因编辑介导的嬖因定点插入和茶

4、因破除3种，注；灰川供体指常见刘闲修饰名称及种类见附录A,33苓因蔓合geneintegration将特定痕因片段导入宿主加因组内的法因修饰方法，包括转基因和%因定点插入，3.4基因KNtgeneknockout将特定基因片段从基因组中去除的基因修饰方式。3.5迨传11定性geneticstabi1.ity通过连续检测不同代数基因修饰动物基因型、基因表达情况来评估基因修饰在动物群体中遗传稳定及表达稳定的手段.3.6XE9if1.ftW3E*genoMstructura1.variants1）B51,31842024在医用供体猪获得过程中，基因组上发生长片段（50bp）的序列变化和位置关系变化.

5、雷西那f1.结构变异包括出T段序期（fi入或删除.中联羽红、染色体倒以染色体内部或臭色体之间的序列别立基因娉贝数变井以及嵌合性变介等.3.7yRJOfHarget与招标不同的荔因也位置和/或核酸序列.示例：站合脱靶、崛帆祀、州眠祀、序列改变脱把，注I编辑脱史风于非预MI倒1匕（*;ISO5O58z1.-2O21,3.1.,413.8高JU1.N序himthru邮Utsequencing以次并行几十万到几百万条核酸分子序列测定和般波长较短等为标志，适用于IWA的测序技术.来海GBT35890-2018.3.114总体朦JN葩因签定是医用供体猪制备过程中正要祖成环节，医用供体猪制备、价选、交付等过

6、程应对其进行基因整定,因此用途的特侏性，医用供体猪葩因签定应同时考虑安全性和有效性，降低因基因修饰技术引入的不可控因素.安全性和有效性评价应结合设计预期、荔因修饰类型迸行烷合评估，密定项目可参考表1.1服用供体案苔因整定评价事目序号系定/检测项目评价类型1基因型有效性评价2亚因表达3迪传造定性遗传稳定检测4必因组钻构变异安全性评价5脱把5聂定9（目及方宏5.1 WtttWMft1 .1.1*89BA5 .1.1.1蔓龙方法样本DNA提取可选用符合要求的中件试剂盒进行提收,也可由实验室自配试剂进行提取,引物设计应在目标茎因（拟整合基因/融除基因迎位）上卜游设计引物.样本DNA提取后，符合质域要求

7、的DNA进行PCR扩增,产物经琼脂械凝胶电泳，观察H标条带判定是否符合预期,和定些因整合见5.1.1.2a）.判定目标基因的是否敲除，应将符合预期的条带网收，进行测序（见5.1.1.2b）.&弭为整合鉴定小例1.WI隶B,植因除卷定，J制见府就。5.1.1.2结果判定a）出现H标条带，则判定携因整介仃效，b）目标片段测序结果和参考序列比对,比位产生不为3的倍数碱基的插入和缺失，则判定基囚被除存效.5.1.2暮因我达5.1.2.1检焉方法选取与目标蛋白相结合的特异抗体对医用供体猪如织、细胞水平进行蛋白检测。可采用蛋白免授印透法、免疫殂化/免疫荧光、物联免疫吸附技术、流式细胞术等方法进行检测。建议

8、根据不同生产工艺选和合适的检测方法，蛋白免疫印透法可作为基础方法选用，蛋白免疫卬进法检测及判定方法可公考GB.T38477.蛋臼免疫印透、免疫祖化（荧光）、油联免疫吸附技术检测示例见附录B流式细胞术技术检测示例见附录C.5.1.22M自免疫印逸法Iaw定a）成僮图片木底干净，能观察到转卬腰均匀的轻微背景轮廓，H标条带清睢旦不过喋，即可判定目标蛋白友达.b）基内整合类应有目标基因蛋白表达，俄除类险无目标基囚蛋白友达.5.25.2.1 爱用要求医用供体猪自然繁什进行拉大化培养时应符合对闭抑或近交系的育种方式,同时应检测基因遗传稳定性.5.2.2 栩M方法医用供体猪群体先代个体均应进行翦因型鉴定和基

9、因表达检测，方法见51.应连控监测3代以上,5.2.3 结果分析医用供体诉期因型骁定及期因表达检测结果符合基因分掰定律和自由组合定律，则认为具有遗传栈定性.5.3 安全性讦价5.3.1 物色体飨种变鼻和BUBtM在基因修饰过程中.存在臾色体结陶变异和基因修饰脱比的风险,应对除代个体进行染色体结构变界和脱祀检测，评价安全性.聚集医用供体猪筋因修饰前后的血液或出织进行高通玳测序，获取医用供体猪制因组序列信息，进行生物信息学分析,祥木处理参照GB,T33681.1的要求执行，测序方法照GBjT30989进行，测序侦*控制参照GBJT35537执行.5.3.2 第果分析5.3.2.1 染色体It构变鼻

10、茹因梅饰前后,除西因修饰位点外,染色体其他区域西因序列无差异，医用供体指基因组未发生甘预期基因片段插入、序列我失、但置、弁位，则认为在医用供体猪制备过程中未引入基因安全风险.5.3.2.2使用CaAOFFin&kCR【SPRRGENToo1.s(rgenome.iwU)或类似律法模型工具，在猪粒因俎春考序列内也纪脱无风险位点，允许SgRNA的比标序列存在1个4个错配，灰用供体垢脱靶各风险位点序列信息和基因狙参考序列致，则认为没有脱靶,反之则存在脱靶风险.MA(*Mtt)医用供体宿Itjut因名及修的突St医用供体诣常见西因名及惟饰类型见表A.1.A.1医用供体着It期(因名及修It类S1.然因

11、敲除GGTA1.I(JAI.VT2B1GI2I.CMA1.IPERVS1.Ac1.assIorR2M基因整合hxvnnnifihmnrcfactrpmt1.6-1.R)humnderny-ncccIcrntingfn:tortrnnxgmic(hCI)65-tg)huatinmettbmeIiihibtorofFeaC1.iVd1.ysistransgenichu11nc：1.obu1.intransenichu11B11sitcna1.regu1.atoryproteina1.phatransgenic(hCD47-tg)humn1.EA29Yt11mx1gcnic(1.J1.A2!,-tg

12、)humnC1.A1-Igtransgenic(IiCT1.M-1.-tgporcineCI1.A4Trtransonic(CI1.4-1g-tg)huwndnninnt-ngativcnutantc1.ossHtransactivatortrdu1.inIranSKeniCQIIBWIg)humnendothe1.ia1.protcinCreceptortraosgcnic(hEI,CR-tg)hunantissuefactorPat1.Wayinhibitortransgenic(hTFP1.-tg)hunanectonuc1.eosidetriphosphatediphosphohydr

13、o1ase-1transgenic(hCD30-t)hum11ecto-5,-nuc1.eoidasetransgenichmtmtUiiwurnecrosisfactor-inducedPrOIein3(1NFAII,3)transgenic(A20-ig)humnhnnwxygmnx1transgenicCR检洪.B.1.2B.1.2.1样品奥相耳机娘、血液警“B.1.2.2W&X*耳样采集，采杼前对采样工具及采样部佗进行消毒,用耳标钳!下猫耳批织，放入1.5m1.点心管中用于基因租提取.血淞采集I使用紫色采血管,采集猪全由3n1.-5m1.B.1.2.3XSttUMAtt一用市色同因If1.DNA提取试剂盒.提取更因ff1.DNA.B.1.3PCRfiB.1.3.1引物序列1.ea29Y上游引物：5-Gtacccaccgccatactacg-J;1.EA29Y下游引物：5,-GCGATGTCGCTGGGATAGAA-3。B.1.3.2PCR及应体JKin程序按照表B.I配置PCR反应体察一m1.)250EK1/10.5下游引物(IQ1m1.1.)250ra1.0.5WKOD0.0125unit/M1.0.25HJfti100ng-500ng2d叫。补足至20H1.6.75注，反应体系中的各纲分可根据不同被终反联体系进行X分.但