B7-H1阻断对膀胱癌患者外周血树突状细胞免疫功能的影响.docx

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1、B7-H1阻断对膀胱癌患者外周血树突状细胞免疫功能的影响B7-H1阻断对膝胱癌患者外周血树突状细胞免疫功能的影响摘要摘要目的：探讨脐胱癌患者外周血与正常人外周血树突状细胞(dendriticcells,DCs)免疫功能的差异以及B7-H1阻断对膀胱癌患者外周血DCs免疫功能的影响。方法：采集膝胱癌患者及正常人的外周血，用rhGM-CShrhl1.-4和rhTNF-自外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)诱导分别DCs,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激淋巴细胞增殖的实力。然后于膀胱癌DCS组加入B7-H1的阻断型抗体，混合淋巴细胞反应检测B7-H

2、1阻断后DCs刺激淋巴细胞增殖的实力，EUSA法检测阻断后DCs分泌I1.-IO和I1.-12的水平。结果：膀胱癌患者外周血DCs刺激淋巴细胞增殖的实力低于正常人外周血DCs,而加入B7-I11阻断型抗体阻断B7-H1后，膀胱癌患者外周血DCS刺激淋巴细胞增殖的实力得到明显提高，同时其分泌I1.-IO水平明显降低，而分泌I1.T2水平明显增加。结论：表面B7-H1的诱导高表达有关，而B7-H1阻断能够增加膈胱癌患者外周血DCs的免疫功能。硕士研究生李贤军指导教师于芹超副教授关键词：膀胱肿瘤：B7TI1；树突状细胞：免疫逃逸青岛高校硕士学位论文引言膈胱癌是泌尿系肿瘤之中最常见的其中的一种1O但是

3、，其在手术并辅以局部灌注化疗后，依旧有着较高的复发率。Brausi2等统计发觉,在行经尿道膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)以后，再以卡介苗(BCG)行规律膀胱港注，仍旧会有部分患者复发,甚至进展。这已经成为泌尿外科亟需解决的问题。有探讨表明，膝胱癌中存在着免疫逃逸现象，而这也是膀胱癌易复发的重要机制之一3。在机体对抗肿瘤的免疫应答机制中，T细胞所介导的免疫反应起着主导作用。但是，T细胞的激活、增殖均需依靠于抗原递呈细胞递呈相应的抗原并供应共刺激信号.树突状细胞(dendriticcells,F)C)作为在当前发觉的体内功能最强，同时，也是惟一能够激活初始的T淋巴细胞的专职抗原提呈细胞，在诱导机体

4、对抗肿病的免疫应答过程中起着非常关键的作用4-5同时，树突状细胞还具有其他特点：一方面，树突状细胞在混合淋巴细胞反应中，能够有效的刺激T淋巴细胞呈现出明显的增殖；其次，在体外分别并刺激成熟而获得的树突状细胞的抗原呈递功能与从体内纯化的成熟的树突状细胞没有明显差别6。有探讨表明，DC在数量上的降低、功能上的缺失或者表达某些异样分子，这些都可能会引起DC免疫功能的下降，进而导致其无法激活T细胞来产生免疫反应，甚至造成免疫耐受，引发肿瘤的发展或转移7O除此以外，共刺激分子供应的协同刺激信号是T细胞活化的前提。最新探讨发觉，B7-H1是一种具有抑制性作用的共刺激分子，也称之为程序性死亡配体-I(PD-

5、1.1,CD274)o当B7-H1与其相对应的受体分子，即PD-I结合以后，会产生抑制性信号，进而引发T细胞的凋亡，并抑制T细胞的活化增殖9-10我们前期探讨发觉膈胱癌患者外周血I)CS表面B7-H1的表达比正常人明显增高，并且其表达水平与膀胱癌的病理分级和临床分期亲密相关11。那么B7-H1在膀胱癌DCs中原委发挥怎样的作用，目前尚未见相关探讨和报道。为此，木探讨通过检测膀胱癌患者外周血DCs与正常人免疫功能的差异以及B7-H1阻断对其免疫功能的影响,借以探讨B7-H1在膀胱癌免疫功能缺陷和免疫逃逸机制中的作用。青岛高校硕士学位论文1.材料与试剂1.l临床资料收集2013年6月-8月青岛高校

6、医学院附屈医院泌尿外科膀胱癌患者外周血10例，其中男8例，女2例，年龄3072岁，均未接受任何抗肿瘤治疗，术后病理结果均证明为膀胱癌。另外取10例健康学生志愿者的外周血作为比照（由青岛高校医学院学生志愿者供应）。2试验方法及步躲2.1J垮胱癌患者及正常人PBMC来源DCS的诱导I.以肝素抗凝的真空采血管采集膀胱癌患者的外周静脉血20ml,用等体积的RPMII640将血液稀释。2 .将5m1.淋巴细胞分别液吸取到离心管中，依据2:1（稀释血液：淋巴细胞分别液）的比例，将稀释后的血液缓缓地加到淋巴细胞分别液的上面。3 .在室温条件下，将离心管放于低速离心机中，采纳密度梯度离心法（2500rmin,

7、20min,r=15cm）分别单个核细胞（PBMC）O离心结束以后，离心管内液体分为四层，中间的白膜层即为PBMCe4 .将PBMC吸取并转移到另一支离心管中，用5倍体积的PBS（含2%FBS）将其稀释并混匀，再以1500r/min的转速离心IOInin,然后去掉上清。5 .mg12次上述的过程，以尽可能的洗掉血小板、淋巴细胞分别液等杂质。6 .用含有10%FBS和1%双抗的RPMI1640培育液将细胞重悬并转移至15cm2的培育瓶中。将培育瓶置于细胞培育箱中，在37C、5%C02条件下接着培育2h7 .轻描培育瓶，吸取上清液及非贴壁细胞至一试管中，离心获得的细胞即为淋巴细胞,然后以含有100

8、g1.DMSO的RPMI1640重悬，转移至冻存管中，梯度降温至-80C条件下保存备用，用时夏苏。8 .培育瓶中剩余贴壁细胞，此时，将含有rhGM-CSF(50ng/ml)和rhI1.-4(50ng/ml)的RPMI1640细胞完全培育基(含10%FBS)加入到培育瓶中，在37匕、5%C02条件下培育。9 .分别于培育过程中的第2、第4天半量换液，同时还要补充加入新的rhGM-CSF和rhI1.4,在第6天的时候，加入rTNF-(25ng/ml),以其来诱导产生成熟的青岛高校硕士学位论文DCs(mf)Cs)10 2膀胱癌DCs上B7-HI的阻断及试验分组膀胱癌患者外周血DCS分别培育后，于培育

9、体系中加入10mg/1.的B7-H1阻断型抗体MIHl,然后试验分为三组：正常人DCs组、膀胱癌DCs组、膀胱癌DCs+B7-Hl阻断组，各组接着培育24h后收获DCs用于进一步试验。11 3混合淋巴细胞反应检测DCs诱导淋巴细胞活化增殖的实力1.将前期分别并冻存的淋巴细胞复苏，用RPMI1640培育液重悬细胞，作为反应细胞，按2105/well加入96孔板。2 .试验组按1：10的比例加入各组DCs,DCs在加入之前以丝裂霉素C(25mg1.)去增殖。空白组加入等量的RPMH640培育液。每孔设3复孔，37C,5%CO2恒温培育箱中培育48h.3 .每孔加入CCK-8约201.,混匀，接着培

10、育约4ho4 .以45Onm波长的随标仪进行检测。以增殖指数(proliferationindices,PI)来比较各组DCs刺激淋巴细胞增殖的实力，PI=试验组D值/空白组D值。2.4E1.ISA法检测DCs分泌I1.-IO和I1.-12的水平1.收集DCs细胞培育液，1200r/min离心10min后收集上清。2 .将E1.ISA试剂盒中所需试剂充分混匀，避开产生泡沫。3 .加样：将标准品以1001./well加入标准孔，I1.-10、I1.-12各以1001./well加入样品孔,将稀释液按1001./well加入空白比照孔。4 .加入检测抗体：将稀释后的抗体依据501./well的浓度

11、加入各孔，混匀，盖封板膜，室温条件下孵育2ho5 .洗板：将板反扣于滤纸上，去除孔内液体，以3001./well加入洗板液，1min后将板反扣，去除液体。重第3次。6 .加酶:以1001.wel1加入Streptavidin-HRP0加盖封板膜，孵育20min（室温）。7 .洗板：同步骤5。8 .显色：加入TMB（1001./well）,在避光条件下,孵育大约15min（室温。9 .反应终止：快速以终止液1001./well终止反应。青岛高校硕士学位论文10.以450nm波长的酶标仪检测D值。最终样品D值=所测得D值空白孔D值，依据标准曲线求出最终的分泌值。2.5统计学分析采纳SPSS19.0

12、统计软件进行统计学分析，试验所得到的数据以Xs表示。两组数据之间比较采纳t检验，以P0.05为差异有统计学意义。3试验结果3.1树突状细胞的诱导培育在倒置显微镜下可以视察到：于培育的第2天，可见单核细胞的形态起先改变，并渐渐呈现半悬浮生长的状态（图3.la）；至第4天，我们可视察到悬浮的细胞团渐渐增加，与此同时，细胞体积的也变大，在细胞周边也可见有少量突起的形成（图3.1b）。至培育的第7天，细胞体略呈圆球形，突起较为明显，此为较典型的DCs（图3.lc）o肿病患者外周血源性的DCS形态和正常人的相比较，状态并无明显的分别。3.1：树突状细胞的培育3.2正常人外周血DCs、膀胱癌患者外周血DC

13、s及B7-H1阻断后膀胱癌患者外周血DCs刺激淋巴细胞增殖的实力膀胱癌患者外周血DCs与正常人外周血DCs相比，其刺激淋巴细胞增殖的实力明显降低,而加入B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1后，膀胱癌患者外周血DCs刺激淋巴细胞增殖的实力得到明显提高（见图3.2）。图3.2各组DCs刺激淋巴细胞增殖实力的比较（*p0.05vs膀胱癌DCS组）膀胱癌DCS组）3.3B7-H1阻断对膀胱痢患者外周血DCs分泌I1.-IO和I1.T2水平的影响B7-H1阻断后,膀胱癌患者外周血DCs分泌I1.-IO的水平明显降低,而分泌I1.-12的水平明显增加（见图3.3）。图3.3B7-H1阻断对膀胱癌DCs分泌I

14、1.-Io和I1.T2水平的影响（*P005vs阻断前）青岛高校硕士学位论文4探讨膀胱癌被认为是一种具有免疫原性的肿瘤，其肿病内存在大量肿描浸润淋巴细胞，这也是膀胱癌对卡介苗免疫治疗敏感的缘由。然而有探讨发觉膝胱病患者体内存在着肿痛获得性免疫缺陷，特殊是影响淋巴细胞的功能，而这也有可能是膀胱癌复发和恶性进展的重要缘由之一6。DCS作为当前发觉的体内功能最强，也是惟一能激活初始T淋巴细胞的专职抗原提呈细胞，在诱导机体抗肿瘤免疫应答过程当中发挥着重要的作用卜2,而DCS的功能异样在肿瘤的发生发展中亦起到至关重要的作用，但详细机制尚不清晰。B7-H1是近些年来新发觉的、与肿瘤的免疫逃逸生物学行为亲密

15、相关的一种具有抑制性作用的共刺激分子。在正常的状况下，B7-H1主要表达于活化的单核细胞和DCs表面7,现已证明其在多种肿痛细胞表面亦存在着过度表达，其与受体结合后能够供应抑制性信号从而抑制相关免疫细胞的活化和增殖。我们前期探讨发觉膀胱癌患者外周血DCs表面B7-H1和CD8T细胞表面PD-I表达明显上调，并且其表达水平与膀胱癌的病理分级和临床分期亲密相关3。本探讨主要检测了膀胱癌DCs与正常人DCs免疫功能的差异以及B7-H1阻断对其免疫功能的影响，结果发觉膀胱癌患者外周血DCS刺激淋巴细胞增殖的实力明显低于正常人，而阻断B7-H1后其刺激淋巴细胞增殖的实力得到明显提高，同时其分泌I1.-IO水平明显降低，而分泌I1.72水平明显增加。这提示膀胱癌患者外周血DCs存在免疫功能障碍，其机制可能与DCs表面B7-H1的诱导高表达有关，而B7-H1阻断能够增加膀胱癌患者外周血DCs的免疫功能。目前对B7-H1参加肿病免疫逃逸机制的探讨多着重于对T细胞免疫应答效应阶段，即肿瘤局部微环境的探讨，针对B7-H1进行的靶向免疫治疗亦多集中在效应T细胞上，而我们探讨发觉B7-H1在T细胞免疫应答的初始阶段也可以通过抑制DCS的免疫功能，进而抑制机体的抗肿瘤免疫，促进膝胱癌免疫逃逸的发生，阻断DCs上B7-H1的表达则能够