2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究_0.docx

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1、2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达探讨2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达探讨（作者：单位：邮编：）作者：柴可夫黄晓玲钱俊文马纲【摘要】目的从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。方法抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血，检测血糖,血脂及电解质，分别血液中的白细胞，提取总RNA,化学发光方法检测基因芯片，用ScanAlyze软件采集图像，GEArrayAnalyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RTPCR和WeSternblOtting方法验证。结果2型糖尿病湿热困脾证患者血糖，血脂，电解质与健康人有显著差异，基因芯片检测发觉和健康人差异表达基因共38条，其中上调的基因有24条，

2、下调的基因有14条。并发现湿热困脾证的特异性基因。通过RTPCR和Westernblotting方法反向验证IRS2和F0XC2基因，证明2型糖尿病湿热困脾证患者和健康人白细胞中存在IRS2和F0XC2存在差异表达。1.结论应用基因芯片筛选2型糖尿病湿热困脾证的差异表达基因，为2型糖尿病辨证论治供应新思路。【关键词】2型糖尿病;基因芯片;辨证分型糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的慢性疾病。因胰岛素分泌肯定或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱为主要共同标记。本探讨视察糖尿病湿热困脾证的基因表达差异，探讨2型糖尿病湿热困脾证的证候实

3、质。1临床资料1.l探讨对象对浙江中医药高校附属其次医院糖尿病防治中心400例糖尿病患者进行中医辨证分型，随机选取6例湿热困脾证患者，其中男性3例，女性3例，年龄30岁至65岁之间，年龄(57.67.7)岁。另选取年龄与性别相匹配的健康人6例作比照，平均为(50.89.4)岁。健康比照组皆通过血糖检查解除糖尿病，通过病史调查和体检、血象、肝肾功能、胸透、心电图等检查，解除其它内分泌疾病和各系统器质性疾病。1.2 现代医学诊断标准依据1999年WHO专家询问报告诊断标准，空腹血糖(FPG)7.0mmol1.(126mgdl);或糖耐量试验(OGTT)中服糖后2小时血糖(2HPG)11.lmmol

4、1.(200mgdl)；或随机血糖11.lmmol1.(200mgdl)。1.3 中医辨证标准参照2002年版中药新药临床探讨指导原则(试行)中中药新药治疗糖尿病的临床探讨指导原则，湿热困牌证,主症：胸脱腹胀，或食后饱满，头身困重。次症：体形肥胖，心胸烦躁，四肢倦怠，小便黄赤，大便不爽。舌脉：舌红苔黄腻，脉滑而数。1.4 病例纳入和解除原则凡符合现代医学诊断标准和中医辨证标准，可纳入试验病例。解除有糖尿病急性并发症；经确诊为1型糖尿病，其它类型糖尿病及妊娠糖尿病者；年龄在40岁以下或70岁以上，妊娠或哺乳期妇女；有严峻心、肝、肾等并发症，或合并有其它严峻原发性疾病，精神病患者。中医辨证症状不典

5、型，或者两型三型并见证型困难者。2试验方法2.1一般状况测量身高，体重。计算体重指数（BMI）:BMr体重（kg）/身高（m2）o2.2 生化检测全部受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml,用于测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白（HbAIc）、胰岛素反抗指数（ISI=In1.1/（FBSFINS）、血钙、血钾等生化检测。2.3 基因芯片检测2.3.1白细胞的提取与RNA的纯化随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml,用红细胞裂解液分别白细胞，采纳Trizol一步法抽提总RNA,用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度，A260/A280比值在1.82.1为

6、较纯的RNA,可用于芯片检测。2.3.2芯片杂交经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。然后进行化学发光检测的Ampo1.abeling1.PR标记，变性的CDNA探针全部加入O.75ml预热的GEAprehyb中，混匀，放在60C待用。弃去杂交管中的GEAprehyb溶液，加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中，60C下6rpm杂交。2.3.3化学发光检测洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶（AP）,再洗膜4次，加入CDPStar化学发光底物至杂交管中，室温孵育2min0用滤纸去除多余的CDPStar溶液，用X射线胶片曝光。2.3.4图像采集和数据分析运行ScanAlyze软件，

7、将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，运用芯片配套软件GEArrayAnalyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。2.4逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法验证部分差异表达基因。2.4.1引物设计将RNA反转录合成CDNA,用Primer5软件设计，由上海生物工程技术有限公司合成。扩增引物PrimerbpIRS2F0XC2actin上游5TTGAGGCGGCTAAGTCT3下游5TCCCAGgATgCTgTTgCS上游5CCTTCTACCgCGAGAACAAG3下游5CCGgGTCGAgCGTCCAGTAG3上游5ATGCCATCCTGCgTCTG3下游5ACTCCTgCTTG

8、CTGATCC33935205662.4.2扩增反应条件：FOXC294oC5min;9430s；60.050s；72oClmin;725min；共30个循环IRS294oC5min;9430s；55.550s；72lmin；725min；共30个循环actin94C5min；94C30s；55.5oC50s；72oClmin；72C5min；共30个循环扩增产物取101的actin和101目的基因在1.2%琼脂糖（含EBO.5ngml）上电泳，紫外灯下视察结果并照相，吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析，结果为基因表达量对actin内参的比值，以上结果重复3次，取平均值。2. 5W

9、esternblotting检测IRS2蛋白的表达抽提蛋白、制备PAGE胶、膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。KCTM化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育5mi11o去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。2.6统计学分析各组试验数据以（XS）表示，采纳SPSSWindowsl3.O软件处理，以OneWayANOVA方法进行方差分析，PO.05

10、为统计学意义显著性标准。3结果3.1糖尿病湿热困脾证临床基本资料间的关系湿热困脾证组BMKHbAlc均高于健康比照组，其间差别有统计学意义（P0.05）,湿热困脾证组ISl显著低于健康比照组（PO.05）O血脂状况视察发觉湿热困脾证的TG水平高于健康比照组（P0.05）；HD1.C水平低于健康比照组（P0.01）；1.D1.C水平明显高于健康比照组，差别有统计学意义（PO.05）o湿热困脾证患者血清钙、血钾均低于健康比照组（P0.05）,见表1、表2、表3。表1糖尿病湿热困脾证与健康比照组BMKHbAlcISI的比较（略）与健康组比较,*P0.05,#P0.01表2糖尿病湿热困脾证与健康比照组

11、TG、HD1.C.1.D1.C的比较（略）与健康组比较，*P0.01表3糖尿病湿热困脾证与健康比照组BMEHbAlc.ISI的比较（略）与健康组比较，*P0.013.2基因芯片检测结果3.2.1总RNA提取结果总RNA紫外分光0D26/0D28在1.82.0之间，提取的总RNA28S、18SrRNA亮而浓条带清楚，RNA样品电泳条带清楚，28S比18S条带的亮度接近2：1,质量符合分类表达谱芯片试验要求，总RNA质量完整无降解。3. 2.2湿热困脾证糖尿病患者的基因表达探讨湿热困脾证糖尿病患者与健康比照组相比，共筛选出表达量变更比值大于2倍的基因38条，其中表达上调的基因有24条，包括受体、载

12、体通道基因5条；分泌基因5条；信号转导基因2条；转录因子基因7条；代谢酶基因5条。表达下调的基因有14条，包括代谢酶基因2条；信号转导基因6条；受体、载体通道基因3条；转录因子基因1条；未知基因1条，见图1、表4、表5o湿热困脾组健康比照组图1化学发光法SuperArrary芯片图（略）表4糖尿病湿热困脾证与健康比照组相比表达上调基因（略）表5糖尿病湿热困脾证与健康比照组相比表达下调基因（略）3.3部分差异基因的验证3.3.1荧光定量PCR检测结果结果显示，两条基因表达均与芯片结果相符合，其中FOXC2（ForkheadboxC2）在湿热困脾证中表达为上调；IRS2（Insulinrecept

13、orsubstrate2）在湿热困脾证中表达为下调，见图2、图3、表6o3.3.2Westernblotting检测结果结果显示IRS2蛋白表达与基因芯片结果相一样，在湿热困脾证中表达削减，见图3。M.DNAMarker;1.健康比照组；2.湿热困脾组图2糖尿病湿热困脾证与健康人IRS2、F0XC2和内参照基因actinmRNA表达（略）1.湿热困脾组2.健康比照组图3糖尿病湿热困脾证和健康比照组IRS2蛋白表达（略）表62型糖尿病湿热困脾证与健康人IRS2、F0XC2mRNA及IRS2蛋白的表达(略)与糖尿病组比较，*P0.014探讨2型糖尿病属于中医消渴的范畴。病因为长期食用肥甘厚腻之品，

14、而致湿热中阻，久而发为消渴。肥胖是湿热困脾型2型糖尿病的重要因素，故湿热困脾证糖尿病患者体重指数较高，肥胖往往伴随胰岛素反抗，本项探讨显示:湿热困脾证的ISl指数显著低于健康人，提示存在胰岛素反抗。湿热困脾证糖尿病患者的血糖、血脂及电解质水平均高于健康比照组；糖尿病患者基因表达与健康人比较，差异表达基因有38条，差异基因总体呈上调趋势。这些基因与肥胖、胰岛素反抗、早期糖尿病及糖尿病的各种并发症有关。IFN属于分泌因子相关基因，是一种由活化T细胞产生，具有抗病毒、抑细胞生长及刺激中性粒细胞及血管内皮细胞生长的生理功能。过去已有多项探讨表明：自身免疫性疾病患者的血清干扰素(INF)反应异样。淋巴细

15、胞产生的IFN介导单核细胞与T淋巴细胞之间的对话。目前认为不仅1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，而且2型糖尿病的发病也与机体的免疫功能亲密相关。2型糖尿病是在遗传基础上由多因素促成的，患者有免疫异样，其胰岛细胞抗体(ICA)阳性者比ICA阴性者有更严峻的细胞损害口。IFN能显著抑制胰岛素的分泌，促进胰岛细胞凋亡2。本探讨中，基因芯片结果中糖尿病湿热困脾证患者的IFN表达上调，显著高于健康比照组，表达差异在2倍以上。1.选择素(Selectin1.,SE1.1.)属于受体、载体及其通道基因，是黏附分子选择素家族的成员之一。近年的探讨显示1.选择素与糖尿病血管病变的发生发展亲密相关3,1.选择素介导的活化血小板与内皮细胞、白细胞的黏附,相互作用，释放活性物质，如血小板源性生长因子(PDGF),血管内皮细胞生长因子(VEGF)成纤维细胞生长因子(FGF)等，促进血管平滑肌增生、结缔组织生成，最终导致动脉粥样硬化的形成4。本探讨中，糖尿病湿热困脾证患者的1.选择素的表达显著高于健康比照组，可能与2型糖尿病患者伴有不同程度血管病变的并发症有关。IRS2蛋白(Mr180Ooo)最初是从骨髓组织中提纯分别，称为4PS,因与IRSl有高度保守结构和一些共同功能，后定名为IRS21.51o已证明IRS2的表达下