包载马钱子碱聚乳酸 羟基乙酸共聚物纳米粒处方工艺优化及其特性研究.docx

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1、摘要：目的对包载马钱子碱(brucine)聚乳酸-羟基乙酸共聚物poly(lactic-co-glycolicacid),P1.GA(B-P1.GA)纳米粒进行处方与工艺优化。方法采用沉淀法制备B-P1.GA纳米粒，以平均粒径、多分散系数(PDI)、Zeta电位、包封率和载药量为评价指标，采用单因素考察法结合星点设计-效应面法(CCD-RSM)筛选B-P1.GA纳米粒的最优处方，并将最优处方进行表征及体外释放实验。结果最优处方选择丙酮作为有机溶剂，泊洛沙姆188(F68)作为稳定剂，超声时间为Imin,磁力搅拌速度为9007min,磁力搅拌时间为30min,F68用量为0.35%,载体用量为2

2、5mg,药物用量为1.Omg,有机相与水相的比为0.54。所制得的B-P1.GA纳米粒为淡蓝色乳光透明液体，粒径为(97.124.23)nm,PDI为0.0980.035,Zeta电位为(-27.300.31)mV,包封率为(69.241.42)%,载药量为(2.650.03)%o通过表征，纳米粒形态完整，通过体外释放实验得知，纳米粒体外释放拟合符合HigUChi方程。结论星点设计.效应面法可用于包载马钱子碱P1.GA纳米粒处方与工艺优化，且优化后的纳米粒具有缓释作用。马钱子碱(brucine)是马钱科马钱属植物马钱子StryChnOSnUX-VomiCa1.种子的主要活性物质1,具有显著性镇

3、痛、抗炎作用2,还具有抗肿瘤、中枢神经系统兴奋等作用3-4,是一种高效的抗肿瘤单体，可用于胃癌、肠癌、肺癌、肝癌、白血病等疾病的治疗，但是由于马钱子碱毒性大、水溶性差、体内代谢迅速，且马钱子碱的治疗剂量与中毒剂量较接近5,故传统制剂不利于马钱子碱发挥药效，从而使其在临床上的应用受到了极大限制。纳米技术在医学方面的应用研究一直备受瞩目，是近年正在发展的一种新型亳微粒类给药系统，可以降低药物的不良反应、延缓体内释放及具有良好的靶向性，纳米药物在改善药物活性及降低药物毒性方面具有独特优势，具有推动药学发展的巨大潜力6-8。目前，聚乳酸-羟基乙酸共聚物poly(lactic-co-glycolicac

4、id),P1.GA载体作为制剂辅料已被美国食品药品监督管理局和欧盟药品局批准用于临床，是制备纳米粒应用最广泛的生物可降解高分子材料，其对脂溶性药物具有较强的包裹能力，同时降解速率规律，可以实现药物的可控释放，在药物制剂领域中具有巨大的开发价值和市场9-11。星点设计-效应面法是近年来常用的一种设计方法，可以很好地完成二次项拟合工作，具有实验次数相对较少、精确度高、操作简单、优选条件预测性好等优点因此，本实验采用该方法结合单因素考察法进行包载马钱子碱P1.GA(B-P1.GA)纳米粒的处方与工艺优化，为马钱子碱进一步临床研究奠定了基础。1仪器与材料1.1 仪器WaterSe2695-2698高效

5、液相色谱仪系统，美国WaterS公司；FA1204B分析电子天平，生物技术有限公司；HJ-3恒温磁力搅拌器，仪器制造有限公司；ZetaSiZerNano-ZS90激光粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗机，超声仪器有限公司；1.VEM5低电压台式透射电子显微镜(TEM),QUANTUM量子科学仪器贸易有限公司。1.2 试剂马钱子碱对照品，批号，质量分数98%,食品药品检定研究院；泊洛沙姆188(F68),德国BASF公司；司盘40,科技有限公司；甲醇，色谱纯，公司；无水乙醇，分析纯，精细化工有限公司。2方法与结果2.IB-P1.GA纳米粒中马钱子碱含量测定2.1

6、.1 检测波长的确定称取适量的马钱子碱对照品，将其溶解到色谱甲醇溶液中，定容到合适的浓度，二级阵列管检测器上设置检测波长190400nm,进行检测。马钱子碱在223.3、265.7、301.2nm处有最大吸收峰，结合相关文献报道44的波长范围，确定265nm为马钱子碱的检测波长。2.1.2 色谱条件色谱柱为D汰maC18(250mmX4.6mm,5m);流动相为甲醇-水-乙酸-三乙胺(230：2.4:0.3)(30：70)；检测波长为265nm；体积流量Im1./min；进样量101.;柱温30。2.1.3 供试品溶液的制备从已经准备好的B-P1.GA混悬液中精确量取IOm1.溶液,将其加入1

7、5m1.色谱甲醇中，在40kHz、200W的环境下超声，时间为20min,使纳米粒破乳，将处理后的溶液用孔径为0.22m的过滤膜滤过后得到B-P1.GA纳米粒供试品溶液。用同样的方法制取P1.GA空白纳米粒溶液。2.1.4 对照品溶液的制备先精确称量3.1mg的马钱子碱，加入甲醇溶液使其定容至25m1.,作为对照品储备液，质量浓度为124.00gm1.o2.1.5 专属性考察分别取P1.GA空白纳米粒溶液、马钱子碱对照品溶液和B-P1.GA供试品溶液在“2.1.2”项色谱条件下进行检测，对其专属性进行考察，结果见图1。可以看到，在该色谱检测条件下辅料对主药马钱子碱的含量测定没有干扰，方法专属性

8、良好，因此符合测定要求。min图1P1.GA空白纳米粒（八）、马钱子喊对照品溶液(B)和B-P1.GA纳米粒(C)的HP1.C图Fig.1HP1.CofP1.GAblankuanopaicles（八）,biucieefeencesolution(B)andB-P1.GAnauopa(ides(C)2.1.6 线性关系考察精密量取马钱子碱对照品溶液10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31m1.,置于Iom1.量瓶中，配制出6种质量浓度的对照品溶液，分别为124.00、62.00、31.00、15.50、7.75、3.88gm1.,按“2.1.2”项色谱条件下进行检测，并记录峰

9、面积，以马钱子碱质量浓度为横坐标(X),色谱峰面积为纵坐标(Y),对其进行线性回归，得到线性回归方程为Y=15539X+39436,r=0.9997,结果表明马钱子碱在3.88124.00gm1.线性关系良好。2.1.7 精密度试验取124.00gm1.的马钱子碱对照品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下Id内测定6次，连续测定6d(每天1次)，口内精密度和日间精密度RSD分别为0.87%和0.90%,说明日内、日间精密度良好。2.1.8 稳定性试验精密吸取同一份B-P1.GA纳米粒供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、10、12h时，按“2.1.2”项色谱条件进样测定。结果发现12h内马钱子

10、碱峰面积RSD为1.12%,表明供试品溶液在12h内稳定性良好。2.1.9 重复性试验分别取同一B-P1.GA纳米粒样品6份，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下测定峰面积，计算得到马钱子碱质量浓度的RSD值为1.04%,表明该方法重复性良好。2.1.10 加样回收率试验精密吸取0.3m1.的空白纳米粒，共9份，分为3组，各组分别精密加入0.3m1.的低、中、高质量浓度(10、40、70gm1.)的马钱子碱对照品溶液，各3份，混匀。将处理后的溶液用孔径为0.22m滤膜滤过，并在“2.1.2”项色谱条件下进样检测并记录，计算加样回收率，结果3种质量浓度溶液的平均

11、加样回收率在98%101%,且其RSD值均小于2%,结果表明该方法符合检测要求。2.2包封率与载药量的测定方法选取几种常见包封率和载药量的测定方法，并对其优缺点等进行分析，选择出适宜的测定方法，不同测定方法实验结果见表1。表1不同测定方法的实验结果Table1Differentmeasurementmethodstestresults测定方法包封率/%RSD%载药量%1RSD，%低沿超速离心法65.540.981.502.730.041.47葡聚糖凝胶色谱法50981.913.752.460.228.94透析法43.181.192.762.440.104.102.2.1 低温超速离心法取出2m

12、1.的B-P1.GA纳米粒混悬液，并将其放置在离心机中，在离心半径40Cm,15000rmin转速下离心30min,将沉淀的纳米粒收集，再用蒸锵水超声使其分散，继续离心，重复3次，然后用孔径为0.22m的过滤膜滤过，计算其包封率和载药量。2.2.2 葡聚糖凝胶色谱法取出2m1.B-P1.GA纳米粒混悬液，将其添加到已经经过处理的SePhadeXG50凝胶柱上，用蒸储水洗脱2min,收集纳米粒，然后用孔径为0.22m的过滤膜滤过，计算其包封率和载药量。2.2.3 透析法将装有2m1.B-P1.GA纳米粒透析袋置于透析外液为含20%乙醇pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，用转速为100Ormi

13、n的磁力搅拌器搅拌4h,取透析内液，用孔径为0.22m的过滤膜滤过，计算其包封率和载药量。包封率及载药量计算公式为包封率=(W2W1)W2,载药量=(W2W1)W3,其中Wl为测得的游离马钱子碱含量，W2为马钱子碱总投料量，W3为B-P1.GA纳米粒总量。由表1可知，通过低温超速离心法得到的药物包封率与载药量最高，最低的是透析法；而且，透析法耗费的时间较长，所以不排除存在纳米粒中药物释放的可能；葡聚糖凝胶色谱法的RSD值较大，可能因为某批次样品稀释过程中导致药物泄露，使得包封率和载药量的数值不稳定；低温超速离心法测得包封率和载药量较高且偏差值较小；因此，本课题最终确定使用低温超速离心法对纳米粒

14、的包封率进行检测。2.2.4 P1.GA纳米粒处方工艺优化2.3.1 制备方法的选择选取几种常见的制备方法，并对其制备过程及优缺点进行分析，选择出B-P1.GA纳米粒适宜的制备方法，不同制备方法实验结果见表2。表2不同制各方法实躲结果(Hs.”3)Table2TestresultsofdifferentPIePamCionmethods(XS,11三3)切各方法平均校4nmPDIZeta电位AnV包封率必载药量%沉淀法86643260.1450010-28M0.7857.392212.230.03夏乳法172.472.750.3340.011-13.290.7245.671.841810.05

15、社析法163111690.1870008-10660.8642081971620.04复乳法：用质量为1.2mg药物和Im1.蒸馈水混合成溶液并将其作为内水相，用Wl表示;然后用25mg共聚物和IOm1.丙酮混合并经过超声处理后作为油相，用O表示；用蒸僧水将聚山梨酯80制备成浓度为0.2%的水溶液作为外水相，用W2表示。操作方法：首先取出O溶液并向其中加入Wl,然后将。与WI的混匀溶液放入细胞破碎仪中，超声30s；然后将其加入到17.6m1.W2溶液中并放入磁力搅拌器中，再次超声30min后得到并W1/0/W2复乳；然后将溶液放入蒸发仪中除去有机溶剂，获得纳米粒溶液。沉淀法：称取出25mg共聚物，将其放入到IOm1.丙酮中，超声使其溶解，该溶液作为有机相。向里面添加1.2mg药物，再次超声使其充分溶解。配制20m1.含0.05%F68的水溶液，将其作为水相，将有机相加入到水相中并将其放在转速为100Ormin的磁力搅拌30min,将溶液放入旋转蒸发仪中除去有机溶剂，获得纳米粒溶液。盐析法：取OSm1.P1.GA共聚物材料的丙酮溶液，加入到1.5m1.含28%MgC12的F68溶液中，混合后的溶液超声3次,每次时间为10s。再加到1.5m1.的溶有IOmg药物