GB_T43166-2023燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测方法.docx

ICS 65.020.20CCS B 16OB中华人民共和家标准GB/T431662023燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测方法2023-09)7 发布TraceabilitydetectionofAcidovoraxavenaesubsp.citrulli2024)4)1实施国家市场监督管理总局分在国家标准化管理委员会发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SACTC271)提出并归口.本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、中国农业大学.本文件主要起草人:章桂明、高瑞芳、王颖、向才玉、黄河清、李娜、张丹丹.燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测方法1范围本文件描述了应用全基因组单核甘酸多态性(WgSNP)方法对燕麦嗜酸菌西瓜亚种进行溯源检测的方法.本文件适用于燕麦嗜酸菌西瓜变种的分子溯源检测.2规范性引用文件本文件没有规疮性引用文件.3术语和定义下列术语和定义适用于本文件.3.1溯源traceability对于一个未知产地的对象,依靠建立特定的技术，实现其原产地的追溯.注，溯源又称为“可追溯性，3.2系统发育树phylogenetictree具有共同祖先的各物种间进化关系的树.注：在进化树中，每个分支节点代表其各分支的最近共同祖先，而节点间的级段长度对应演化距离.3.3单核昔酸多态性singlenucleotidePolyn)OrPhEn；SNP在基因组水平上由单个核甘酸的变异所引起的DNA序列多态性.3.4全基因组单核昔酸多态性wholegenomesinglenucleotidepolymorphism；WgSNP在全基因组水平上由单个核甘酸的变异所引起的DNA序列多态性.4病菌的基本信息中文名：燕麦嗜酸菌西瓜亚种，又称瓜类果斑病菌、西瓜细菌性果斑病菌、西瓜细曲性果腐病菌.学名IAcidovoraxaenaesubsp.citrulli(Schaadetal.«1978)Willemsetal.1992最新命名iAcidovoraxcitrulli(Schaadetal.)Schaadetal.«2008异名：PSelw/omomzsavenaesubsp.citrulli(Schaadetal.»1978)Huetal.«1991PSeudomonasPseudoalcaligenessubsp.citrulliSchaadetal.,1978分类地位；原核生物界(PrOCaryOtae),变形菌门(PrOteObaCteria变形菌纲(BetaPrOteObaCteria),从毛单胞像科(ComamOnadaCeae),噬酸曲属(ACHowaz),西瓜亚种(ACidOVorjravenaesubsp.c"rui).该病曲的其他相关资料见附录A.5方法原理燕麦喳酸菌西瓜亚种溯源检测方法的原理是通过全基因组测序技术发掘物种的w&SNP位点.基于得到的审核甘酸多态性信息构建系统发行树进行聚类分析,从而对物种进行溯源归类.6仪器和器具恒温培养箱、恒温摇床、黜净r作K火茵鼠JfR¥增仪.冷冻感心机、核醐需而分析也一巾流仪、凝胶成像系统、-20T组液器、冻存管、培养皿、酒精灯、接种针.试剂：7,酒必匕TAB、PCRTaq .PCR Taq缓冲液、dNTP、无菌超耳7试剂和培养鹫/Xk评估质控使用CTAB法或商业DNA取方法见附求C.提取后通过PCR扩全境丹组测序、数据在超净TN囊代产保存的前株川LB固体培养施用接种针少除Jy板培养皿上划纹法活化.于28C恒温感出?K了2d3d备用./8.3 D、A提取与纯化增伐对其进行PCR犷增并用电泳仪对PCR产物进行电泳，热后使用凝胶成像系统进行检测.用核酸蛋白检测仪测定DNA浓炭及纯度后保存于一20t冰箱备用.8.4 全其因组测序以模式菌侏(REF)或来源明确的葭株的全基因组序列为参考基因组,采用全基因组鸟枪法(WGS),利用测序仪对构建的PE(Paircd-End)文库进行2X15ObP测序,测序彳f效深度(SequencingDePth)应达到200X.即测序所得到的碱基(bp)总俄与待测物种趋冈组(Gsome)大小的比值应达到200.8.5 数据评估质控对待测物种测序的原始数据(rawreads)通过通用生物信息分析软件进行质量评估，然后通过通用生物信息分析软件进行质量剪切，确保得到的数据有效、准确.8.6 序列比对按照通用生物信息分析软件列出的流程开展序列比对：a)使用通用生物信息分析软件将待浏物种基因组有效数据与参考基因组(8.4)进行比对；b)使用通用生物信息分析软件转换比对结果的格式并对其排序；c)统计比对结果；d)使用通用生物信息分析软件进行重定序列的标注(MarkDUPIiCateShe)根据比对结果进行冗余序列(duplicatereads)分析、插入片段长度(insertSiZe)的分布等分析；D利用通用生物信息分析软件进行深度覆盖率统计分析.8.7 SNP检酒利用通用生物信息分析软件的识别单倍型(HaPlOtyPeCaHer)算法分析待浏物种基因组和参考基因组之间的基因型差异，对待测物种的SNP进行分析,得到变异信息并统计变异位点.8.8 系统发育分析将待测物种的全基因序列单核昔酸多态性位点按相同顺序串联起来，得到一条fasta序列(参考附录D),然后将每个菌株等长的fasta序列输入到建树分析软件，再通过系统发育树邻接法(NJ法)基于WgSNP构建系统发育树,对曲株(含参考菌株)进行亲绿关系分析。9结果判定根据待测物种序列在系统进化树上与已知来源的燕麦嗜酸菌西瓜亚种的分支聚集结果进行判定： 如果待溯源物种与巳知来源物种序列聚为一支，支持率为100%,即可判定待溯源物种与已知溯源物种具有相同的来源地； 如果待溯源物种与已知来源物种序列聚为一支，支持率低于100%,即可判定该物种与已知溯源物种疑似为相同的来源地； 如果待溯源物种未与已知来源物种序列聚为一支，则判定该物种与已知溯源物种不是同一来源地.10样品与原始数据保存10.1 样品保存分离得到的菌种转移至LB液体培养其，在恒祖摇床中28C培养36h,加入20%灭菌甘油，置于一80匕条件下保存至少12个月或采用无菌水保存法，严格防止扩散，保存期满后，经高温高压灭菌处理.10.2 结果记录保存完整的实骏记录包括:样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字.PCR产物凝胶电泳检测褥有电泳结果照片，浏序全基因组序列需要保存电子文件.A.1分布附录A（资料性）基本信息亚洲：中国、印度尼西亚、伊朗、以色列、日本、4来西亚、韩国、泰国、土耳其.欧洲：希腓.匍牙利、意大利，荷;留晔北美洲：加拿大、哥斯达居普岛、尼加拉大洋洲：澳大利亚4/Ej南美洲伫西Zjo多巴好、美国.A.2寄主范辣椒（Cannuum八西瓜（CitrullusIamlnCS八甜瓜（CtmniSvar.emit，"，八、nv；：CMw）.网纹甜瓜（Use/。VKSl，、黄鎏函葫壹£西。）番茄J例>¾Wr触侵染幅眼域堂叶和y子叫第酗害时.肯典喇1；现水浸M其叶摩初E.隼镰£小点马甜瓜（Cm也、哈密瓜（C.Lsacc呈黑阊展成暗后迅速米AfK没歌凹陷班点,随人果肉.绿色或1.洞状上,透明掰珀附录B（资料性）燕麦嗜酸菊西瓜亚种溯源检刑流程燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测流程见图B.I.图B.1燕麦喑酸菌西瓜亚种溯源检的流程附录C（资料性）基因组DNA制备C.1DNA制备使用下列CTAB方法提取病菌DNA,或使用商业化试剂盒提取DNA.a）菌株的培养及DNA制备的前处理.D将菌株接种于装有LB液体培养基试管中置于恒温摇床上28t摇培28h.2）在试管中加入0.1mol/L磷酸钠短冲液10mL洗下赭体.3）将细菌悬浮液转移至灭菌的离心管中，置于冷冻离心机中12OOOg下离心15min,弃上清液b）DNA的提取.1）在沉淀中加入TE缓冲液5mLJ0SDS溶液300fL,20mg/mL蛋白酶K30混匀371注水浴锅中水浴1h.2）加入等体积的三氯甲烷/异戊髀（24：1）,混匀，10OOOg离心5min,将上清液转移至新的灭菌离心管中.3）加入等体积的酚/三氯甲烷/异戊醉（25S247）混匀，10OOOg离心5min,将上清液转移至新的灭菌离心管中.4）加入06倍体积的异丙醇,轻轻混合至DNA沉淀下来JOOoog离心5min,弃上清液.5）用】mL的70%乙醇沉淀洗涤后，离心弃乙醉,在超净工作台中晾干,加入50BLTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20C可长期保存.C.2DNA浓度及纯度测定用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度,分别取得260nm和280nm处的吸收值，按照公式（Cl）计算DNA纯度，按照公式（C.2）计算DNA浓度：_ODzsoCOnC=瓯p=50XOD2m式中：cone.DNA纯度PDNA质量浓度，单位为微克每妄升（gmL）,ODw6260nm处吸光光度值,核酸的吸光度；ODm-280nm处吸光光度值，蛋白质的吸光度.PCR级DNA溶液的ODm/ODwe比值为1.71.9.附录D（资料性）整考的株WgSNP位点序列参考菌株WgSNP位点序列>REFCttttagtgattcaactgggaccgtcaggcctcgccgatcgttccggtggtgaaacttcatgcgtgggtArCCGGeTCTATCGTACTCCACTCGACTTAGTCGGGTCGGGCCAGGCCTCACGTTCEAGCGATGTTGAAtctccacgtgctgggtgtttcgcgggcccgcggcatggtctgtgctctaacggcgtcacgacagccttGtctgactgggatcaggggtgccggtctcggacctactcacgtggccgtcggccacattcgacgcacgGGCGeTCCACGAeCTGGCCCCCTGCTTGCAGTCTCAATTATCGGCCTGGGGAATGTCGTGGTCGGATIACACGGGTGGTGATCCCGGTTGGGCCACGAEGGCACCATnTAAGCCACCAGTCGAGGGCCCAGAATCGtgggtatccgtcccagtagcctatgcacgcactttgtgccgtagggcggggcggtgttgcgggcggagGGCGCTGGACGGGTGGCACGCGGGTGCATAECGCTATGGTAAGCTGATGTTACACCGTTGCCTGTAGGcaagggtgccggagtctgccggacgagcgcccggggtttctgttataatcagcggcgatcgccctgccGTCGCACTGGAGTGCTAGTAGGGTCTGCCTACATAGGGAATTTTGAACGCGGATTCGGACGTGACCAGCTggtctcccataccgctcgtaaaacggcggc