重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化影响的体外研究.docx

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化影响的体外研究陈聪,罗庆，毕扬，陈肯，田雯，迭小红，曹光彪，周建武，康权(400014重庆，儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室、儿科学重庆市重点实验室、重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国际科技合作基地，m庆医科大学附属儿童医院)摘要目的探讨重组腺病毒介导的小鼠骨形态发生蛋白-9(AdV-InBMp9)诱导小鼠胚胎肝干细胞向成熟肝细胞定向分化的影响。方法将已构建的表达小鼠BMP-9、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒，分别感染小鼠胚胎肝干细胞，诱导其分化，然后采用半定量PCR,Real-timePCR.细胞免疫荧光、荧光素酶报告基因检测等方法检测甲胎蛋白(AFP).白蛋白(A1.B)和细胞角蛋白18(CK18)等肝细胞标志物的表达。结果半定量及Real-timePCR检测，与对照组相比，诱导7d后的BMP-9组、HGF组的AFP表达下降(P<0,05),A1.B的表达明显升高(P<0,05):细胞免疫荧光染色，诱导7d后的细胞胞浆内表达肝细胞特有的A1.B、CK18等蛋白，而对照组几乎无表达：荧光素酶报告基因检测，诱导Id、4d、7d的肝干细胞的A1.B表达较对照组明显升高(P<0.05)结论BMP9有诱导小鼠胚胎肝脏干细胞向成熟肝细胞样细胞分化的作用，并且BVP9对小鼠胚胎肝干细胞的诱导分化作用强于传统的肝干细胞诱导分化因子HGF。关键词骨形态发生蛋白9：小鼠胚胎肝干细胞；分化；重组腺病毒中图法分类号文献标志码ADifferentiationofmousefetalliverstemcellsinducedbyAdenovirus-mediatedmousebonemorphogeneticproteins-9invitroChenCong,1.uoQing,BiYang,ChenKen.TianWen，DieXiaohong,CaoGuangbiao,ZhouJianwu.KangQuan(MinistrjrofEducationKey1.aboratoryofChildDevelopmentandDisorders,Key1.aboratoryofPediatricsinChongqing,ChongqingInternationalScienceandTechnologyCperationCenterforChildDevelopmentandDisorders,Children'sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing.40014.China.)AbstractObjectiveTbexplorethedifferentialregulationofmousefetalliverstemcellstomaturehepatocytesafterinducedbyrecombinantadenovirus-mediatedmousebonemorphogeneticproteins9(Adv-mBMP9).MethodsThemousefetalliverstemcellsinfectedbytheconstructedrecombinantadenovirusexpressingBMP9、HepatocyteGrowthFactor(HGF)、andgreenfluorescentprotein(GFP).Toinvestigatetheregulationofstemcellsdifferentiation,alphafetoprotein(AFP),albumin(A1.B)andcellkeratin18(CK18)weretestedbyhalfquantitativePCR,Real-timePCR,cellularimmunefluorescenceandfluorescentelementenzymegenereport.ResultsComparedtotheGFPcontrolgroup,theexpressionofAFPinducedwithBMP9andHGF7dayslaterwasdecreasedtestedbyhalfquantitativePCRandReal-TimePCR(P<0,05).Onthecontrary,theexpressionofA1.Bwasincreased(P<0.05).Thespecificmarkerofmaturehepatocyte,A1.BandCK18havestrongexpressionafter7daysinductionwhichweretestedbycellularimmunefluorescenceassay,andthenegativeresultwereobservedwiththeGFPcontrolgroup.TheexpressionofA1.BafterId,4dand7dinductionwithBMP9andHGFinstemcellswassignificantlyincreasedcomparedtoGFPcontrolgrouptestedbyfluorescentelementenzymegenereport(P<0,05).ConclusionBMP9canpromotethemousefetalliverstemcellsdifferentialprocedureandinduceittothematurehepatocytes.Furthermore,thisfunctionisevenstrongerthanthetraditionalroleoflivercelldifferentiationfactorHGEKeywordsBMP9;mousefetalliverstemcells：differentiation;recombinantadenovirusSupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina().theNaturalScienceFoundationofChongqing(CSTC2OO8BB539O),theNaturalScienceFoundationofChongqing(CSTC2009BB5408)andKeysubjectofChongqingMedicalUniversity.(XBZD20I015).Cwcspondingauthor：KangQuan.Tel:86-23-,E-mail：基金项目国家自然科学基金()；重庆市自然科学基金(CSTC2008BB5390)：重庆市自然科学基金(CSTC2009BB5408)：重医校际重点课题(XBZD201015)通信作者康权，电话(023),E-mail：肝细胞移植在先天性肝病、终末期肝硬化的治疗中具有广阔的应用前景，但由于肝细胞在体外不能大量扩增且传代后不能保持其原有特性而难以推广应用，相反肝脏干细胞具有长时间持续增生的能力，能在体外扩增获得足够数量肝干细胞，但如何优化稳定成熟诱导体系使肝干细胞向肝细胞定向分化，是目前国内外研究的难点。如能在获得足够数量肝脏干细胞的基础上，采用某种方法进行干细胞修饰，定向诱导肝脏干细胞分化为成熟肝细胞，则该修饰后的肝干细胞必将在治疗各种急慢性肝病所致肝硬化、肝衰竭中发挥巨大的作用。近年来有文献报道BMP在肝脏重建再生方面”及抗肝纤维化的作用咒本课题组前期已经对BMP做了大量的基础工作3,并通过对BMP2-15的筛选，发现BMP9对骨髓间充质干细胞的定向诱导分化作用。本实验目的在于探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠肝干细胞的诱导分化作用，以探讨小鼠胚胎肝干细胞体外培养的最佳诱导因素，从而建立有效的诱导肝干细胞定向分化为肝细胞的体外培养体系，为临床.肝细胞移植打4基础。1材料与方法1. 1主要材料试剂小鼠胚胎肝干细胞细胞株HP14-19（美国芝加哥大学医学分子肿瘤实验室合作分离鉴定）、DMEM培养基、胎牛血清（GBICO公司）、Trizol试剂（Invitrogen公司）、RT-PCR试剂（Promege公司）、PCR试剂（北京天根生物公司）、Real-timePCR试剂（北京百泰克公司）、1.UmiFleXGIUC检测试剂盒（NEB公司）、POIybrene（SIGMA公司）、白蛋白抗体、CK-18抗体及二抗（SantaCruz公司）重组腺病毒介导的小鼠骨形态发生蛋白-9、重组腺病毒介导的小鼠肝细胞生长因子的构建由本课题组完成、保存，测序工作由芝加哥大学分子实验中心完成，dv-mBMP9.Adv-mHGF和Adv-GFP带GFP标签蛋白，可以在荧光显微镜下观察病毒的感染情况。Primer3.0软件设计引物，引物由深圳华大基因公司合成，引物序列见表1。表1RT-PCR引物序列基因引物序列（5,至3，）扩增片段（bp）A1.B上游：Ccagacattccccaatgc122bp下游：CaagttccgccctgtcatAFP上游：Acgaggaaagcccctcag125bp下游：GccattccctcaccacagCK18上游：Ctgggctctgtgcgaact125bp下游：AcagagccaccccagacaBMP9上游：Cgcagccttaacctcagc120bp下游：GttggaggcaggcgtagaHGF上游：Ttcccagctggtctatggtc237bp下游：TggtgctgactgcatttctcGAPDH上游：Acccagaagactgtggatgg171bp下游：Cacattgggggtaggaacac1.2 细胞培养及实验分组HP14-19细胞常规培养于含10%的胎牛血清的DMEM中，37、5%CO2的条件下培养于培养箱中，间隔48h左右，0.25%胰酶消化传代，备用。本实验分3组，AdV-mBMP9组;AdV-InHGF组;Adv-GFP对照组，每组设置复孔，于腺病毒感染后不同时间段观察、检测各项指标。1.3 病毒感染HP14-19细胞滴度的确定将HP14-19细胞按细胞密度20%左右接种于24孔板中，待细胞贴壁后密度达到40%左右，在相同细胞培养条件下，各组分别加入不同浓度梯度的Adv-mBMP9>Adv-mHGF>Adv-GFP,并且同时加入5lPolybrene试剂,摇匀后放入培养箱培养，并于腺病毒感染48h后，在荧光显微镜下通过感染细胞的萤光量来确定病毒的最合适感染滴度。1.4 检测重组腺病毒介导的BMP9在感染诱导HP14-19细胞后BMP-9的表达情况确定出上述各组不同浓度梯度下感染腺病毒的最佳感染滴度后，按上述条件接种于6孔板后按相同条件感染HP14-19细胞，并于诱导分化后7d提取细胞总RNA进行逆转录，按照试剂说明书操作，逆转录完成后分别以CDNA为模版扩增BMP9、HGF基因，并设置GAPDH为内参对照。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，分析条带，检测重组腺病毒感染HP14-19细胞后BMP-9、HGF基因是否成功表达。1.5 RT-PCR.Real-timePCR检测A1.B.AFP等肝细胞特征性标志物将HP14-19细胞细胞接种于6孔板中，当细胞密度达到40席左右后，每组分别加入适宜浓度的Adv-mBMP9>Adv-mHGF、Adv-GFP,同时加入10lPolybrene试剂，感染7d后，各组细胞分别加入ImlTriZOI试剂，按RNA提取试剂说明书提取细胞的总RNA,检测提取的