谷子SiNPF4.12基因在根系和籽粒发育过程中的功能研究.docx

谷子SiNPF4.12基因在根系和籽粒发育过程中的功能研究摘要：谷子具有突出的耐贫瘠特性，氨素吸收利用效率高，解析其氨高效分子机制具有重要的理论和应用价值。SiNPF4/2基因主要在根中表达，SiNPF4.12蛋白定位于细胞膜，爪蟾卵母细胞电生理实脸表明其具有硝酸盐吸收活性。为阐明该基因在谷子生长发育过程中的功能，本研究利用基因编辑技术创制了一系列SiNPF4/2基因功能缺失突变体，获得了一个10bp缺失的纯合突变体和一个IbP插入的纯合突变体。i5hj丰度检测发现，该基因突变导致谷子豆素吸收效率降低。该突变体籽粒明显小于野生型，且在正常氨素条件下，根系明显短于野生型，表明SiNPF4/2基因协同调控了谷子氨素吸收和根系与籽粒的发育。关键词：谷子；SiNPF4.12;基因编辑；氮素吸收FunctionanalysisofSiNPF4.12geneduringrootandgraindevelopmentAbstract:Foxtailmillethasoutstandingcharacteristicsofbarrentoleranceandhighnitrogenabsorptionandutilizationefficiency.Itisofgreattheoreticalandpracticalvaluetoanalyzethemolecularmechanismofnitrogenefficiency.SiNPF4.12geneismainlyexpressedinroot,andSiNPF4.12proteinwaslocatedinplasmamembrane.ElectrophysiologicalexperimentsofxenopusoocytesshowedthatSiNPF4.12hasnitrateuptakeactivity.InordertoelucidatethefunctionofSiNPF4.12geneduringthegrowthanddevelopmentoffoxtailmillet,wecreatedaseriesofSiNPF4.12genedeletionmutantsusinggeneeditingtechnology,anda10bpdeletionmutantanda1bpinsertionmutantwereobtained.The15Nabundancetestshowedthatthemutationofthisgeneledtothedecreaseofnitrogenuptakeefficiencyinfoxtailmillet.Thegrainsizeofthemutantwassignificantlysmallerthanthatofthewildtype,andtherootofthemutantwassignificantlyshorterthanthatofthewildtypeundernormalnitrogenconditions,indicatingthatSiNPF4.12geneco-regulatedthenitrogenuptakeandrootandgraindevelopmentoffoxtailmillet.Keywords:foxtailmillet;SiNPF4.12;geneediting;nitratetransport1前言11.1 谷子的起源11.2 谷子的产业发展前景11.3 氮素与氮高效机制12材料和方法22.1 培养基配方22.2 抗生素22.3 农杆菌介导的拟南芥花序侵染32.4 农杆菌介导的谷子愈伤转化42.5 K5NO3标记法测定氮素吸收效率52.6 亚细胞定位52.7 烟草瞬时表达83结果与分析93.1 SiNPF4.12具有硝酸盐转运活性93.1.1 SWPF4/2基因主要在根中表达93.1.2 SiNPF4.12蛋白定位于细胞膜103.1.3 SiNPF4.12蛋白具有硝酸盐转运活性103.2 SiNPF4.12基因在谷子根系和籽粒发育过程的功能研究123.2.1 SiNPF4.12基因编辑谷子的创制123.2.2 SiNPF4.12基因突变影响根系发育和籽粒大小133.2.3 SiNPF4.12基因突变影响谷子根系氮素吸收144讨论17参考文献错误!未定义书签。致谢错误!未定义书签。1前言1.1 谷子的起源谷子(Seiariaitalica),亦称稷、粱，北方称谷子，俗称小米，属禾本科狗尾草属，起源于我国黄河流域，是我国的传统优势作物。谷子的栽种生产在我国由来已久，是我国古代的主要粮食作物。时至今日，谷子在我国的种植面积中依然处于各类农作物中的前位。谷子的种植适宜于温带和热带气候，因而在历史上多栽种于中国、日本与欧洲等温热带地区。1.2 谷子的产业发展前景我国是农作物生产、农业用种大国。种业是农业领域的战略核心。当前，我国种业发展还存在着较大隐忧：种质资源保护利用与种业原始创新能力不足，种业创新体制机制存在短板。近年来，谷子由于在杂交选育、品种推广以及基因学等领域的研究取得良好进展，谷子有关种业正不断发生种种从无到有的突破。中国在谷子的种质鉴定、创制研究、高效育种途径研发、关键性状协调表达与调控规律解析以及新品种真实性鉴定方法探索等方面的原始创新型进步为我国谷子种业发展提供了重大支撑，并且已经形成了一套初具规模的种业原始创新技术。我国对谷子的研究除有效推动了种业发展外，还为功能基因组研究模式植物的提出产生了巨大作用。谷子具有较小的二倍体基因组、较小株高、高繁殖系数以及诸多便于繁殖、操作的特点，故而是遗传学在分子水平研究中模式植物的良好选择。谷子已具备了较高水平的参考基因组序列，在种质资源、突变体库构建和遗传转化体系完善等领域都具有良好研究基础。且其配套的平台技术设施也逐渐完善。作为模式植物的谷子发展前景喜人，现在，山西农业大学杂粮分子育种团队创制了“xiaomi”,并建立了一套便捷高效且稳定的Xiaomi遗传转化体系。它作为极具发展潜力的C4禾谷类模式植物，弥补了拟南芥和水稻作为模式植物的不足设。1.3 氮素与氮高效机制氮是作物生长发育所必需的大量元素，其对作物最终产量的贡献接近一半，是植物生长的限制性因素。但在我国，氮肥低利用率的大量使用产生的进入生态系统的过量氮肥，势必带来一系列环境问题。因此，如何提高作物氮素利用率已成为农业发展所面临的重大问题网。硝态氮是植物吸收利用的主要氮源，其吸收利用是一个复杂协调的调控过程。当前,由于缺乏明确的分子调控机制解释作物的氮素利用过程，阻碍了农业生产的发展n°L谷子具有耐瘠薄特性，是氮素吸收利用机制研究的理想材料。利用基因工程改良作物氮素吸收利用相关基因，培育氮高效品种具有重要意义。因而，利用有关种质资源，挖掘氮肥利用相关基因、解析其遗传调控网络，将优异等位基因用于育种，是目前的重要工作2材料和方法培养基配方1.B液体培养基:5g/L酵母浸粉(yeastextract)+10g/L蛋白族(peptone)+10g/L氯化钠(NaCI)1.B固体培养基:5g/L酵母浸粉(yeastextract)+10g/L蛋白陈(peptone)+10g/L氯化钠(NaCl)+15g/L琼脂粉(Agarpowder)MS固体培养基：4.43g/LMS盐+30g/L蔗糖(SUCn)Se)+8g/L琼脂粉(Agarpowder)pH5.81/2MS固体培养基：2.2gLMS盐+20g/L蔗糖(SUCroSe)+8g/L琼脂粉(Agarpowder)pH5.8CIM(callusinductionmedium)：4g/LN6basalsaltwithvitamins+30g/Lsucrose+2mg/L2,4-D+0.3g/Lcaseinacidhydrolysate+2.8g/Lproline+0.1g/Lmyo-inositol+0.1mg/L6-benzylaminopurine+4g/LphytagelpH5.8IM(infectionmedium)：0.44g/LMSsalts+1×B5vitamins+68g/Lsucrose+36g/Lglucose+1g/Lasparagine+1g/Lcasaminoacids+0.2g/Lcysteine+2mg/L2,4-D+200MAS(acetosyringone)pH5.2SIM(shootinductionmedium)：4.43g/LMSbasalsaltwithvitamins÷30g/Lsucrose+1g/Lproline+1g/Lasparticacid+0.5g/Lcaseinacidhydrolysate+0.25mg/Lcoppersulfate+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+50mg/Lhygromycin+8g/LagarpH5.7RIM(rootinductionmedium)：2.2g/LMSsaltswithvitamins+30g/Lsucrose+0.1g/Lmyo-inositol+2.6g/LgelzanpH5.62.1 抗生素氨茉青霉素(AmP)：50mg/mL溶于水；卡那霉素(Kan)：50mg/mL溶于水；利福平(Rif)：50mg/mL溶于DMSO(二甲基亚飒)；壮观霉素(Spe)：50mg/mL溶于水；头狗霉素(Cef)：300mg/mL溶于水；竣茉青霉素(Car)：250mg/mL溶于水；潮霉素B(Hyg)：50mg/mL(ROChe购买)；草铉瞬水剂(BaSta)：10%(生工生物购买)。2.2 农杆菌介导的拟南芥花序侵染（1）将构建好的拟南芥过表达载体电击转入农杆菌GV310k（2）在含有相应抗生素的LB液体培养基中，28°C培养菌液至OD6oo=1.0°（3）将摇好的菌液分装于离心管中，600OrPm离心5min。（4）弃上清，将农杆菌悬浮于相同体积的侵染液中。侵染液配方：5%蔗糖+2.03g/LMgCI2+100LLSilwet-77o（5）将拟南芥已结的角果剪掉。置侵染液于培养Inl中，浸染花序1.5min。（6）将侵染后的拟南芥封上地膜，保温保湿，在黑暗条件下培养1天。（7）间隔一周，再侵染一次。（8）将收获的TO代种子播种于含有筛选标记（BaSta）的1/2MS固体培养基中，筛选2周。（9）将转基因植株转移至不含筛选标记的1/2MS固体培养基中培养3天用以壮苗。（10）将壮苗结束的转基因植株转移至蛭石：营养土3:1的营养钵中进行培养，培养条件为：昼夜时长16/8h,昼夜温度22/20C,光照强度9000Lx。农杆菌介导的谷子愈伤转化具体步骤参照图U图1农杆菌介导的谷子愈伤转化步骤流程图Fig.1FlowchartofstepsofAgrObaCteriUm-mediatedmilletcallustransformation2.5 K5NO3标记法测定氮素吸收效率（1）选用籽粒饱满的种子，用1%NaQO溶液消毒20min,用蒸储水冲洗5次。（2）将种子播种于黑色水培盒，蒸馈水萌发3天。（3）将萌发一致的幼苗在营养液中培养10天，每3天更换一次营养液，营养液配方见表1,培养条件为：昼夜时长1410h,昼夜温度2822°C,光照强度30000Lx。表I谷子水培营养液成分Table1Nutrientsolutioncomponentfo