茯砖茶中真菌的分离鉴定.docx

茯砖茶中真菌的分离鉴定摘要：【目的】探究茯砖茶中优势真菌的种类及形态学特征，为茯砖茶发花过程中实现人工干预促进优势真菌生长，提高茯砖茶品质，实现标准化生产提供理论依据。【方法】本实验以茯砖茶“发花”过程样(第9d)作为实验材料，通过真菌分离纯化技术对茯砖茶中的真菌进行分离纯化，平板培养进行菌落形态学观察、ITS区域序列同源性比对与系统发育分析方法对其进行聚类鉴定。【结果】结合形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，将分离纯化得到的6种真菌鉴定为：金花菌(Aspergilluscristatus)、琉球曲霉(AspergillusIuchuensis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、皮落青霉(PenicilliumCrUStoSUnI)、灰绿曲霉(ASPergUIIUSglaucus)>黑曲霉(ASPergilIUSniger)【结论】茯转茶“发花”过程样(第9d)中优势真菌主要集中于曲霉属、青霉属真菌，以上种属的特定作用，促进了茯砖茶独特风味品质的形成。关键词：发花；优势真菌；形态学特征；ITS序列分析IsolationandidentificationoffungiinFuBrickteaAbstract:ObjectiveToexplorethespeciesandmorphologicalcharacteristicsofthedominantfungiinFuBrickteatea,soastoprovideatheoreticalbasisforartificialinterventiontopromotethegrowthofthedominantfungi,improvethequalityofFuBrickteateaandachievestandardizedproduction.(MethodInthisexperiment,thesampleofthetlooming,processofFuBricktea(No.9D)wastakenastheexperimentalmaterial.ThefungiinFuBrickteawereseparatedandpurifiedbythetechniqueoffungiseparationandpurification.Thefungiweregroupedandidentifiedbythemethodsofcolonymorphologyobservation,ITSregionalsequencehomologycomparisonandhylogeneticanalysisinplateculture.(ResultsCombinedwiththeresultsofmorphologicalidentificationandmolecularbiologicalidentification,thesixfungiisolatedandpurifiedwereidentifiedas:AspergillusCriSlaIus、AspergilIus山ChUenSis、AspergillusOryZac、Pcnicilliumcrustosum>Aspergullusglaucus、Aspergillusniger.tConclusionThedominantfingiinthellblooming,processofFuBricktea(No.9D)weremainlyAspergillusandPenicilliumfungi.ThespecificeffectsofthesefungipromotedtheformationoftheuniqueflavorqualityofFuBricktea.Keywords：Hairflower;Dominantfungi;MorphologicalCharacteristicsJTSsequenceanalysis弓I2材料与方法21 .1实验材料22 2实验主要试剂22.1.1 培养基制备22.4.3 真菌的形态学观察32.4.4 菌株ITS序列分析33数据处理44结果与分析54.1 *fa»54.2 菌株的分子生物学鉴定94.3 鉴定最终结果105讨论11参考文献13致谢错误!未定义书签。1引言茯砖茶，是种紧压黑茶，最先产自陕西泾阳，后发展至湖南、浙江、四川等地，距今已有600多年历史。茯砖茶因其砖身内要通过特定环境控制和培养一种被称为“冠突散囊菌”的黄色菌落，具有特殊的保健功效和独特的品质特征，并作为“边销茶”家族的特殊成员而闻名于世。微生物大量参与茯砖茶的后发酵过程川，这些微生物有的本来存在于茶叶表面，有的是在后期加工工艺中自然生长的。茯徜茶的后发酵工艺与其它黑茶稍有不同，主要分为2个阶段：一是黑毛茶阶段，刚采摘的鲜叶通过系列工艺制成黑毛茶。渥堆是该阶段的主要工艺，是湿热作用、微生物及其胞外酶的共同作用。二是发花阶段，黑毛茶经过汽蒸、压制成型、发花等工艺步骤形成茯砖茶。发花是茯砖茶加工的独特工序，决定着获豉茶中优势菌的种类和数量,其实质是在一定的温湿度条件下，破内优势菌一一冠突散囊菌（俗称“金花”）大量生长繁殖，它们进行物质代谢及分泌胞外酶进行酶促作用，形成茯砖茶独特的风味品质。长期饮用茯砖茶有益于人体健康叫如抗氧化、助消食、调节血脂、减肥、逆转动脉粥样硬化、促进肠道健康等"L历来学者对茯砖茶中微生物的种名、生长特性及生物学特征均进行过一定研究，但获砖茶产地众多，除湖南以外，四川、浙江、陕西等省也产茯砖茶，所以对于不同产地茯成茶之间占主导作用微生物的研究并不够全面。近年来茯砖茶中微生物的研究主要集中于湖南产区的样品，陕西产区的研究还比较少，而茯砖茶最早于陕西泾阳自然“发花”成功，其得益于其环境中的天然微生物，以及适宜真菌生长繁殖的气候、水质、温度、湿度等自然条件阴。曾经有“离开了泾河的水、关中的气候、陕西人的技术不能制”的“三不能制”的说法U%更加印证茯砖茶作为陕西地理标志性产品的独特性。为此，本实验以陕西产区内的茯砖茶“发花”过程样为研究对象，通过真菌分离纯化培养技术对茯砖茶中的真菌进行分离纯化，再通过菌落形态学观察、分子鉴定技术对其进行聚类鉴定，以期能够了解陕西产区茯砖茶“发花”过程中优势真菌的种类及形态学特征，进一步研究不同地域品种茯砖茶之间优势微生物的差异及其品质形成机制,为促进茯砖茶市场统标准的建立和新产品的开发提供理论依据。/ 批注11：大标IS在加个/3.数据处理2材料与方潴2.1 实验材料茯砖茶“发花”中期样（第九天）（100Og）2.2 实验主要试剂葡萄糖、琼脂、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、七水合硫酸镁、氯化钾、蔗糖等，均为分析纯。乳酸酚棉兰染色液，析标科技有限公司。2.3 实验主要仪器与设备表1主要仪器名称TablelMaininstrumentname仪器名称型号生产厂家立式高压蒸汽灭菌器LDZX-50L上海申安医疗器械厂超纯水器UPD-I-IOT四川优普超纯科技有限公司电热鼓风干燥箱DHG-9I45A上海一恒科学仪器有限公司超净工作台SW-CJ-2F济南森亚实验仪器有限公司生化培养箱SPX-150B上海力辰邦西仪器科技有限公司超凡型小容量恒温培养振荡器SPX-200B上海世平实验设备有限公司数控超声波清洗器KQ-250DE昆山市超声仪器有限公司生物显微镜XSP-8CA上海佑科仪器仪表有限公司数码显微镜ED388DI麦克奥迪（厦门）精密光学有限公诃电子天平BSA22O2S赛多利斯科学仪器（北京）有限公司2.4 实验方法2.4.1 培养基制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯去皮，挖去芽眼，洗净，切片，取200g置于IoOOmL蒸镯水中，文火煮沸30min,双层纱布过滤后加入葡萄糖20g、琼脂20g再次煮沸（过程中需不断搅拌），加蒸播水在IL容量瓶中定容，121C灭菌20min°普通察氏培养基：取IOoOmL蒸储水文火煮沸后加入NaNo33g、KH2PO31g、硫酸亚铁0.01g、MgSO47H2O0.5g、KCl0.5g>蔗糖30g、琼脂20g使其完全溶解后，加蒸储水定容至IoOomL,121C灭菌20min°2.4.2真菌的分离纯化温琼英州对于茯砖茶中真菌最适生长条件的研究表明，茯砖茶中真菌在28C,自然PH的PDA培养基中长势最佳n（1）称取IOg茯砖茶茶样（有肉眼可见金花菌部分），放入装有玻璃珠的三角瓶中，加入90mL无菌水在恒温振荡培养器中以180rmin振荡30min,洗脱茶叶中附着的菌体。将去除茶叶的洗脱液制成浓度为10的菌悬液，取5支试管分别编号1-5依次放入试管架，吸取IOmL至灭菌的1号试管，再从1号试管吸取ImL悬液至2号试管加入9mL无菌水混匀制成浓度为IO-?的菌悬液，依次操作至5号试管，获得浓度为10到IO。的菌悬液，每个梯度分别用移液枪吸取（吸取前先将菌悬液混匀）200HL菌悬液涂布于PDA固体培养基平板上，倒置于28C恒温生化培养箱中避光培养6d。（2）采用三点法对稀释平板涂布后长出真菌菌落进行多次分离纯化培养，直至平板只长出同一种形态的真菌菌落并对其进行编号，每天观察菌落的生长状况并根据中国真菌志及真菌鉴定手册对其种属进行初步鉴定。（3）对已经在培养皿上长出单个纯菌落的菌株,在超净工作台中用接种环挑取少量菌丝接种在PDA斜面培养基上，转移至生化培养箱中培养5d后，于4的冰箱中保存，并根据实验进程，定期进行继代培养。2.4.3真菌的形态学观察从PDA斜而培养基中挑取纯菌落，接种在普通察氏平板培养基上，于生化培养箱中28'C,培养13d,每天观察菌落形态特征，并对菌落的大小、颜色、质地、光泽度、隆起状态、边缘特征等形态学特征做好记录。培养57d时，挑取菌落用乳酸酚棉兰染色液染色6min后通过光学显微镜与数码显微镜进行形态学观察。2.4.4菌株ITS序列分析用三点法对菌株进行纯化培养7d后，挑取少量菌落，接种于PDA斜而培养基中，于生化培养箱中避光恒温培养，直至长出明显菌落，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。（1）真菌基因组DNA的提取（CTAB法）参照Saghaii和GUOI闾等的方法，取足量的纯化真菌置于无菌的研钵中，加入适量石英砂和PVP,倒入液氮充分研磨后，将研磨物转移至eppcndorf（2mL）管中，65C预热Ih,加入3%的CTAB（ImL）,在65的恒温水浴锅中保温50min;取上清液700UL,转移至2mL的EP管中，加入等体积的氯仿轻轻颠倒混匀多次，4下，12000Vmin离心IOmin,重复抽提1次，转移上清液于新的EP管中，加入2倍体积的无水乙醇混匀，于-20冰箱中静置30min,4°C下，12000rmin离心IOmin；除去上清液，于EP管中加入800UL乙醇（75%）,轻轻颠倒EP管几次，除去上清液。重复上述操作2次，将沉淀物置于超净工作台中风干：向风干的EP管中加入适量（30UL）的去离子水溶解DNA,获得的DNA,于-20C的冰箱中保存备用。PCR扩增百采用通用引物（见表2）对真菌进行序列扩增，具体反应流程：94C预变性5min；94变性30s、58退火30s、72延伸30s,循环30次；最后72C延伸IOmin,PCR反应体系（见表3）表2PCR扩增引物序列Table2PrimersforPCRamplification菌种