最新：人类白细胞抗原基因分型技术平台规范化建设及临床应用专家共识.docx

最新：人类白细胞抗原基因分型技术平台规范化建设及临床应用专家共识摘要人类白细胞抗原(HLA)基因位于人染色体6p2L31区域，占人基因组的1/3000。HLA基因结构复杂，具有多基因性、高度多态性、单体型遗传、连锁不平衡、种族差异性、区域分布性等特征。近年随着HLA基因分型技术的不断创新，对技术平台的规范化建设、临床检测项目性能验证和性能确认方案的实施、检测全流程的质量控制、结果的分析和解读、供者选择的咨询和临床应用等方面都带来新的问题和挑战。本共识结合我国HLA基因分型技术在临床开展的实际情况，系统梳理了HLA基因分型技术平台规范化建设及临床应用中的关键内容。第一部分从人员、仪器设备、试剂和耗材、实验方法学、环境等方面，提出规范化建设HLA分型技术平台的基本要求，介绍了NGS技术检测HLA基因分型性能确认方法及性能指标的选择。第二部分重点阐述HLA基因分型检测前、中、后全流程质量控制的关键点，HLA基因分型结果报告和发布的质量控制，结果解读和信息系统的管理。第三部分重点叙述HLA基因分型的临床咨询和推广应用。在广泛征求国内HLA和移植领域专家的修改意见和反复讨论后定稿，旨在推动HLA基因在医学领域的发展及临床应用。人类主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)位于人类6号染色体短臂的21.31区域，DNA片段长度3600Kb,由一组紧密连锁的基因群组成，其编码的抗原分子在人类称为人类白细胞抗原(humanleukocyteantigens,HLA),HLA具有结构复杂、多基因性、高度多态性、单体型遗传、连锁不平衡等特征7。HLA-A、B、C属于经典HLA-I类基因座位，HLA-DR、DQ.DP属于经典HLATl类基因座位，HLA-E、F、G、H属于非经典HLA-I类基因座位。最新国际免疫遗传学/人类白细胞抗原(IPDTMGT/HLA)数据库(2023-043.52版本)公布HLA-I类位点共有25509个等位基因，HLA-II类位点共有10754个等位基因。基因测序分型(sequencingbasedtyping,SBT)技术是HLA基因分型的金标准，具有特异性强及准确性高的特点；但其针对HLA-I类基因座位的第2、3、4外显子以及HLATI类基因座位第2、3外显子的关键区域进行扩增和测序，存在测序区域覆盖不全、难以判断不能确定等位基因型分型结果等局限性。近年来，国内外已使用下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术进行HLA基因分型，NGS技术是对HLA基因组全长序列进行测序，其测序的深度和广度都高于SBT法，具有通量大、速度快、可同时检测经典HL-I类和HLA-H类基因、非经典HLA-I类基因等优势，并且98%以上样本可直接获得唯一、最高等位基因分辨率的分型结果，不仅为患者赢得了最佳的临床治疗及移植时间，而且为HLA基因在异基因造血干细胞移植(allogenichematopoieticstemcelltransplantation,alIo-HSCT)、疾病相关性、药物和输血不良反应等临床研究中的应用提供科学依据。因此，HLA基因分型从最早血清学技术到NGS技术的革命性突破，对HLA配型实验室技术平台的规范化建设、质量管理控制、结果报告和解释、临床应用等方面，均带来新的问题及挑战。由于HLA具有复杂的等位基因多态性、种族差异性，因此，其存在分型技术的选择、结果分析和判读、结果解释和临床咨询等相关问题，都可能会影响HLA基因分型检测结果的准确性及临床决策。为解决HLA基因分型技术中关键问题，在参考国内外相关指南、行业标准、规范和文献的基础上，中国输血协会人类组织抗原专业委员会、中华医学会血液学分会组织HLA、移植等相关领域的专家共同起草了本共识，系统梳理了HLA基因分型技术平台规范化建设及临床应用中的关键内容，对于WS/T785-2021人类白细胞抗原基因分型检测体系技术标准中的内容不重复阐述2，第一部分HLA基因分型技术平台规范化建设一、建设HLA基因分型技术平台的基本要求（一）申请开展临床检测的资质推荐意见L对于开展HLA基因分型等临床检测服务的实验室（简称：实验室），应依据并符合卫办医政2010194号文件医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法的要求申请备案，各省市可根据卫生行政部门对技术审核和登记备案的管理要求实施后开展临床检测工作。实验室可根据自身发展需求申请中国合格评定国家认可委员会(ChinaNationalAccreditationServiceforConformityAssessment,CNAS)组织的IS015189医学实验室认可3,及美国组织相容性和免疫遗传学协会(AmericanSocietyforHistocompatibilityandImmunogenetics,ASHD实验室国际认证等4o实验室开展HLA基因分型等临床检测项目，应将接收的样本视为具有潜在感染性样本进行处理。为了防止检测前，如接收和处理样本过程中产生的气溶胶；检测过程中如扩增子污染；检测后医疗废弃物处理等造成生物安全隐患，特别是实验室如接收外部样本，尤其是境外样本，考虑可能存在潜在感染风险更大，建议进行生物安全实验室(bio-safetylaboratory,BSD2级备案。如果HLA基因分型由检验科、病理科等科室开展，可与所在科室一同备案。(一)场地和设施的要求推荐意见2：实验室根据开展的临床检测项目、检测物、覆盖专业及生物安全要求设计实验场地，必须按功能设计生活区和工作区，工作区可分为普通和核心区域。单向设计人流、物流(试剂或耗材)、样本流、污物流（废弃物、废水）、气流（清风、送风、排风）。合理布局逃生通道、喷淋和洗眼装置、防火设备、卫生设置等，以及配备温湿度设备、监控设备（冷链、摄像）、服务器和数据储存设备、生物安全柜等。1 .设施设备：实验室可设置独立的样本接收室，配备电脑、通讯设备和紫外消毒设施，以满足样本接收时各类送检信息核对、登记和录入、与临床沟通完善送检信息、患者及供者样本整理、接收与拒收以及暂存样本的需求。2 .生物安全防护：实验人员在样本接收和处理时，应按照BSL-2要求做好个人防护，对样本外包装进行消毒及统一处理。标本开盖易产生气溶胶、溢洒等，该类操作均在生物安全柜内按标准操作规程（standardoperationprocedure,SOP）进行。实验结束后，应按照医疗废弃物处理原则对实验废弃物、废液进行处理，并对生物安全柜等设备进行清理、消毒和维护。3 .防污染措施：实验室应按照WS/T785-2021行业标准的规定，建立防污染检测体系和擦拭检测措施。（三）人员资质的要求推荐意见3：实验室应根据从事技术平台不同，配备有相应学历、专业和资质证书的专业技术人员。对于关键岗位技术人员，如实验室质量和技术负责人、授权签字人、给出临床建议、咨询意见和解释的人员等，在申请相关实验室认证时，均有一定的要求。1 .结果审核人员：大学本科以上，在实验室工作经历至少5年以上,熟练掌握各项技术，具有分析和解决常见问题的能力。2 .结果报告发布人员：实验室应对报告发布人员的资质予以规定，如CNAS认可实验室对于授权签字人的资质要求：本科、5年以上专业经历、中级以上职称；ASHI认证实验室要求报告发布岗位人员应经过相关认证机构授权，通常由实验室负责人、主管担任。3 .结果解读、临床咨询、临床建议人员：经实验室主任授权，由具有专业背景、技术能力、工作经历、研究能力和沟通能力等综合能力体现的专业人员从事该工作。CNAS.ASHI建议临床咨询岗位人员应具有医学检验、生物学等相关专业博士学历学位，或临床医学本科及以上学历学位，通常由实验室主任、负责人或其他由实验室主任授权人员担任。（四）培训与考核推荐意见4：实验室应针对不同岗位、年资、职称等，制定分阶段的岗位培训计划及相应的考核内容和方法。培训内容应包括但不限于实验室相关制度、生物安全、专业技术、质量管理、仪器设备使用和维护等。培训方式可为实验室集中面授、专业组内培训、独立实验操作等。员工经培训并通过考核后授权上岗，从事与培训内容对应的岗位工作。实验室对人员的培训、考核及周期应按照WS/T785-2021行业标准、CNAS.ASHI有关规定执行。可对新员工、老员工、轮岗员工设置不同的培训内容和考核时间，低年资人员应侧重考核实验操作能力，高年资人员应侧重考核解决问题能力。建议新入职人员应首先接受实验室相关制度和生物安全培训，再接受专业技术和质量管理相关培训，培训时长一般要求3个月以上。(五)仪器、试剂的选择推荐意见5：实验室必须根据临床需求选择经确认符合临床预期用途的检验程序，应选择国家药品监督管理局(NationalMedicalProductsAdnIiniStratiOn,NMPA)批准注册的试剂和仪器开展临床检测项目I5L并进行性能验证。性能验证应满足但不限于试剂生产商说明书中声明的内容，结果应符合试剂说明书中性能指标的参数。实验室除按照试剂、仪器说明书的要求外，还应参照医学检验相关国标、行标等要求,建立仪器、试剂和耗材的采购、评估和储存，仪器使用、维护、维修和校准等必须的SOP文件。1 .基于Luminex技术平台应用序列特异性寡核昔酸探针(SeqUenCespecificoligonucleotideprobe,SSOP)方法进行基因分型：应配备流式荧光检测仪及配套分析软件，试剂包括扩增、杂交试剂，仪器数据采集所需的鞘液、校准微珠等。2 .基于SBT技术进行基因分型：应配备基因测序仪，试剂主要包括扩增及测序试剂，基因扩增产物纯化试剂、产物测序前溶解核酸的试剂，如高度去离子甲酰胺及基因分析仪所用的分离胶，如POP-7聚合物等。还需要配备与试剂配套的HLA基因分型分析软件。3 .基于NGS技术进行基因分型：应配备高通量测序仪及配套分析软件,可依据测序读长、测序通量，综合考虑测序准确率、运行时间、测序成本、测序质量，结合生物信息支持的可用性、平台的灵活性、可扩展性等，选择边合成边测序、半导体测序、联合探针锚定聚合测序等测序平台。文库构建试剂建议选择扩增子文库构建法或探针杂交捕获法的配套试剂；选择无核酸去离子水、分子生物级无水乙醇；实验的各种量程枪尖、PCR反应管等耗材推荐选用低吸附度耗材。4 .NGS技术上机测序试剂：根据测序仪型号和检测通量选择高通量测序平台的上机测序试剂。不同型号测序仪配套上机测序试剂不同，同型号测序仪也配备有不同通量的上机测序试剂。5 .生物信息平台设备基本要求：NGS平台数据量较大，需配备服务器或工作站电脑满足分析软件要求。电脑配置应满足生物信息分析的要求，数据储存建议配备服务器或其他存储设备，并进行异地备份。6 .其他仪器设备：配备包括核酸抽提仪、浓度测定仪、基因扩增仪、电泳系统及成像系统、磁力架（可放置96孔板、2ml离心管）、恒温孵育仪、核酸片段分析仪、QUbit荧光定量仪、超净台、生物安全柜、纯水仪、离心机、移液器、冰箱及混匀震荡仪等设备。（六）服务协议的评估和签署推荐意见6：实验室接受委托检验服务，应与委托检验的机构签订服务协议。服务协议中的内容应包括但不限于协议双方的责任和权限，实验室资质，HLA基因分型技术平台和分辨水平，质量控制管理能力，项目价格，报告发放时间，样本采集、运送、保存的要求，临床咨询及解答临床疑难病例的服务，报告发放对象保密性规定，合作时间等内容。经双方协商后签署服务协议，并应定期评审服务协议。1 .检测要求：实验室依据协议中送检样本检测目的不同，如移植前患者和供者HLA基因分型、二次移植供者选择、HLA杂合性缺失（IOSSofheterozygosity,LOH）检测、HLA与疾病相关性等，实验室应与委托方协商后明确采用的方法学，以满足检