第9章蛋白质组学.ppt
蛋白质工程蛋白质工程 Protein Engineering第九章第九章 蛋白质组学蛋白质组学第一节概第一节概 述述第二节蛋白质组学研究的内容第二节蛋白质组学研究的内容第三节蛋白质组学研究的技术方法第三节蛋白质组学研究的技术方法第四节第四节 蛋白质组研究的应用与发展趋势蛋白质组研究的应用与发展趋势蛋白质组学的含义：蛋白质组学的含义：蛋白质组蛋白质组(Proteome)指的是由一个基因组或一个细胞、指的是由一个基因组或一个细胞、或或一种生物表达一种生物表达的所有的所有protein。蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)旨在阐明生物体全部蛋白质的旨在阐明生物体全部蛋白质的表表达模式达模式及及功能模式功能模式。内容包括：内容包括：蛋白质的表达（定性鉴定、定量检测）、存在蛋白质的表达（定性鉴定、定量检测）、存在方式（细胞内定位）、相互作用研究等，最终揭示蛋白质方式（细胞内定位）、相互作用研究等，最终揭示蛋白质功能，是基因组功能，是基因组DNA序列与基因功能之间的桥梁。序列与基因功能之间的桥梁。第一节概第一节概 述述一、一、蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)的发展简史的发展简史 基因组研究已经取得了举世瞩目的成就。已完成了大肠杆基因组研究已经取得了举世瞩目的成就。已完成了大肠杆菌、酿酒酵母、果蝇、线虫、河豚、水稻、小鼠等十多种生物菌、酿酒酵母、果蝇、线虫、河豚、水稻、小鼠等十多种生物基因组基因组DNADNA的全序列分析。人类基因组计划在的全序列分析。人类基因组计划在20022002年完成。但年完成。但是新问题也随之产生。是新问题也随之产生。l大量的这些新基因编码的蛋白质有什么生物学功能？大量的这些新基因编码的蛋白质有什么生物学功能？l在细胞合成蛋白质之后在细胞合成蛋白质之后,这些蛋白质还要经历这些蛋白质还要经历翻译后的加工翻译后的加工修饰修饰。即一个基因对应的可能是几种甚至是数十种。包容了数。即一个基因对应的可能是几种甚至是数十种。包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的如何运转的？或者说这些蛋白质？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。正是在此背这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。正是在此背景下景下,蛋白质组学应运而生。蛋白质组学应运而生。蛋白质组概念的提出：蛋白质组概念的提出：蛋白质组（蛋白质组（proteome）一词最早由澳大利亚学者一词最早由澳大利亚学者 Wilkins和和Williams于于1994年提出。年提出。源于蛋白质（源于蛋白质（protein）与基因组）与基因组（genome）两个词的杂合。意指）两个词的杂合。意指proteins expressed by a genome。即。即“一个基因组、一个细胞或一种生物表达的所有一个基因组、一个细胞或一种生物表达的所有protein”。蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics）是研究与基因相对应的蛋白质组是研究与基因相对应的蛋白质组的学科。的学科。一个基因主要通过一个基因主要通过mRNA选择性剪接、选择性剪接、RNA编辑、蛋白翻译编辑、蛋白翻译后加工后加工等方式，可编码多个蛋白。因此人类基因组包括等方式，可编码多个蛋白。因此人类基因组包括34万万个基因，但蛋白质组估计在个基因，但蛋白质组估计在10万个左右。万个左右。DNA基因组基因组“基因组学基因组学”mRNA RNA组组“RNA组学组学”蛋白质蛋白质蛋白质组蛋白质组“蛋白质组学蛋白质组学”细胞功能细胞功能基因组学和蛋白质组学的生物化学关系基因组学和蛋白质组学的生物化学关系从从mRNA水平不一定能预测细胞中相应蛋白质的水平，因为：水平不一定能预测细胞中相应蛋白质的水平，因为：l各种各种mRNA不同的稳定性和不同的翻译效率能够影响新蛋白质不同的稳定性和不同的翻译效率能够影响新蛋白质的产生；的产生；l存在存在mRNA选择性剪接、选择性剪接、RNA编辑、翻译后加工和修饰等方式。编辑、翻译后加工和修饰等方式。对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同组织、不同细胞中的表达情同一基因组在不同组织、不同细胞中的表达情况各不相同。况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组的特点：蛋白质组的特点：蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)的概念：的概念：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体角度分析细胞内动态变化兴科学，其目的是从整体角度分析细胞内动态变化的的蛋白质组成成份蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态表达水平与修饰状态，了解，了解蛋蛋白质之间的相互作用白质之间的相互作用与联系与联系，揭示揭示蛋白质功能与细蛋白质功能与细胞生命活动的规律胞生命活动的规律。l8080年代固相化年代固相化pHpH梯度的发明。改善了双向凝胶电泳的重复梯度的发明。改善了双向凝胶电泳的重复性和上样量；性和上样量；l8080年代后期发明的电喷雾电离质谱和基质辅助激光解吸电年代后期发明的电喷雾电离质谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，成功应用于蛋白质分析。离飞行时间质谱，成功应用于蛋白质分析。l蛋白质双向凝胶电泳图谱的数字化和分析软件的发明。建蛋白质双向凝胶电泳图谱的数字化和分析软件的发明。建立了各种蛋白质数据库。立了各种蛋白质数据库。当今蛋白质组研究的蓬勃发展，归功于三大主要技术突破：当今蛋白质组研究的蓬勃发展，归功于三大主要技术突破：第二节第二节 蛋白质组学研究的内容蛋白质组学研究的内容一、蛋白质组学研究的内容：一、蛋白质组学研究的内容：l表达蛋白质组学表达蛋白质组学 研究某种细胞或组织中蛋白质组的组成成分。即实现所有研究某种细胞或组织中蛋白质组的组成成分。即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。支柱技术支柱技术：双向凝胶电泳双向凝胶电泳、质谱技术质谱技术、生物信息学生物信息学。l结构蛋白质组学结构蛋白质组学 测定蛋白质的三维，阐明结构与功能的相互关系。测定蛋白质的三维，阐明结构与功能的相互关系。蛋白质蛋白质结构分析技术结构分析技术有：有：X射线晶体衍射法、核磁共振法。射线晶体衍射法、核磁共振法。l功能蛋白质组学功能蛋白质组学 揭示蛋白质之间的相互作用、揭示蛋白质之间的相互作用、建立细胞内信号转导通路的建立细胞内信号转导通路的相互作用网络图相互作用网络图，研究技术研究技术有：酵母双杂交、免疫共沉淀、表有：酵母双杂交、免疫共沉淀、表面展示技术、面展示技术、SPR等。等。与基因组研究比较，蛋白质组研究更为复杂和困难：与基因组研究比较，蛋白质组研究更为复杂和困难：l 蛋白质组的多样性；蛋白质组的多样性；（不同细胞、同一细胞不同状态时）（不同细胞、同一细胞不同状态时）l 蛋白质种类不确定；蛋白质种类不确定；蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质数目大大超过基因数目。l 蛋白质组的动态性；蛋白质组的动态性；随时间和空间而变化。随时间和空间而变化。l 蛋白质组学研究技术的缺陷；蛋白质组学研究技术的缺陷；如低丰度蛋白、极酸极碱蛋白、如低丰度蛋白、极酸极碱蛋白、极大分子量蛋白、难溶蛋白（如膜蛋白）等的分离与分析。极大分子量蛋白、难溶蛋白（如膜蛋白）等的分离与分析。当前主要任务当前主要任务:发展高通量、高灵敏度、高准确性的发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台研究技术平台是现在乃是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。二、蛋白质组学研究的难点：二、蛋白质组学研究的难点：对机体或细胞的所有蛋白质进行鉴定和功能分析。所用对机体或细胞的所有蛋白质进行鉴定和功能分析。所用的技术方法包括两个方面：的技术方法包括两个方面：一、蛋白质分离技术一、蛋白质分离技术二、蛋白质分析和鉴定技术二、蛋白质分析和鉴定技术双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学（图像分析、数据分析、数据库和计算机网络）分析。学（图像分析、数据分析、数据库和计算机网络）分析。第三节第三节 蛋白质组学研究的技术方法蛋白质组学研究的技术方法一、蛋白质分离技术一、蛋白质分离技术（一）样品的制备方法（一）样品的制备方法要尽量保持其原有的活性和生物学功能。要尽量保持其原有的活性和生物学功能。1.一般分离方法一般分离方法2.激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术不同发育时期、不同生理、病理状态下不同细胞类型其蛋白表不同发育时期、不同生理、病理状态下不同细胞类型其蛋白表达不一致。因此蛋白表达分析应该精确到细胞和亚细胞水平。达不一致。因此蛋白表达分析应该精确到细胞和亚细胞水平。LCM可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞或细胞群细胞群。即是一种原位切割技术。即是一种原位切割技术。优点：优点：快速简单、高效直观、减少交叉污染；保持分离样品结快速简单、高效直观、减少交叉污染；保持分离样品结构完整。构完整。缺点：缺点：用于显微切割的组织必须脱水干燥；捕获大量组织细胞用于显微切割的组织必须脱水干燥；捕获大量组织细胞需要大量时间；组织标本缺乏盖玻片与屈光介质，使得观察模需要大量时间；组织标本缺乏盖玻片与屈光介质，使得观察模糊。糊。激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection，LCM)（二）二维凝胶电泳技术（二）二维凝胶电泳技术（two-dimensional electrophoresis，2-DE）为为19751975年由年由FarrelFarrel和和KloseKlose发明。利用蛋白质的等电点和发明。利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。原理：第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦原理：第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),(IEF),再在第一向垂直方向上进行第二向再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)。特点：特点：l 可分离可分离1010100 kD100 kD分子量的蛋白质分子量的蛋白质 l 高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率l 便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 l 可与质谱分析匹配可与质谱分析匹配 2-DE2-DE技术的缺点技术的缺点：l分辨能力还有待提高。分辨能力还有待提高。l极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质、低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。极小蛋白质、低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。l质谱分析时需要将蛋白质酶解。而胶内酶解过程费时、质谱分析时需要将蛋白质酶解。而胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。费力，难于与质谱联用实现自动化。发明的新型非凝胶技术：发明的新型非凝胶技术：液相色谱法（液相色谱法（liquid chromatography，LC）毛细管电泳（毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）二、蛋白质分析和鉴定技术二、蛋白质分析和鉴定技术（一）图谱分析技术（一）图谱分析技术双向凝胶电泳根据等电点和分子量可一次性双向凝胶电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白分离数千种蛋白质质，经染色后蛋白质再，经染色后蛋白质再PAGE上可形成密度不同、分布不均上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。的复杂点图谱。如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋质点进行检测、定
