毕业设计黄芩苷抗金黄色葡萄球菌α溶血素作用机制的确证.ppt

简介简介金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus,（简称为金葡菌）是（简称为金葡菌）是常见的革兰氏阳性致病菌，是极其重要的人兽共患病原体。常见的革兰氏阳性致病菌，是极其重要的人兽共患病原体。12本研究应用定点残基突变和荧光淬灭试验验证黄芩苷与本研究应用定点残基突变和荧光淬灭试验验证黄芩苷与-溶溶血素的结合位点。通过将血素的结合位点。通过将-溶血素氨基酸序列中的溶血素氨基酸序列中的Tyr148、Pro151和和Phe153突变为丙氨酸（突变为丙氨酸（Ala），表达和纯化野生型），表达和纯化野生型-溶血素及突变体溶血素及突变体-溶血素，应用荧光淬灭试验测定结合常溶血素，应用荧光淬灭试验测定结合常数，结果表明，突变后的数，结果表明，突变后的-溶血素与黄芩苷的结合明显降低溶血素与黄芩苷的结合明显降低，结合常数大小为野生型，结合常数大小为野生型 F153A P151A Y148A。通过。通过脱氧胆酸诱导的寡聚化和脱氧胆酸诱导的寡聚化和SDS-PAGE验证了黄芩苷对验证了黄芩苷对-溶血溶血素七聚体形成的影响。素七聚体形成的影响。材料与方法材料与方法菌株及载体：菌株及载体：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌8325-4 大肠杆菌大肠杆菌DH5、BL21主要试剂主要试剂：PBS缓冲液缓冲液 Amp 贮液贮液 IPTG 贮液贮液 离子离子交换缓冲液（交换缓冲液（Buffer A）离子交换缓冲液（离子交换缓冲液（Buffer B）5 mM脱氧胆酸钠溶液脱氧胆酸钠溶液 仪器仪器：普通：普通PCR扩增仪扩增仪 电泳系统电泳系统 凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统 超声波细胞破碎仪超声波细胞破碎仪 Akta purifier 恒温水浴锅恒温水浴锅 超净工作超净工作台台 生化培养箱生化培养箱 恒温摇床恒温摇床 紫外分光光度计紫外分光光度计 制冰机制冰机 高高速离心机速离心机材料与方法材料与方法方法：方法：1 hla及及hla突变体的引物设计突变体的引物设计2 基因组提取基因组提取3 hla-pGEX-6P-1载体的构建和原核表达载体的构建和原核表达4 QuikChange法对法对hla基因进行定点突变基因进行定点突变5 Hla重组蛋白和突变蛋白的大量表达和纯化重组蛋白和突变蛋白的大量表达和纯化6 荧光淬灭试验荧光淬灭试验7 SDS-PAGE观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla寡聚体形成的影响寡聚体形成的影响8 溶血试验溶血试验结果结果1 hla-pGEX-6P-1载体的构建和原核表达载体的构建和原核表达1.1 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌hla基因的克隆及序列分析基因的克隆及序列分析1.2 重组重组Hla的可溶性分析的可溶性分析1 PCR扩增得到的扩增得到的hla基因电泳图基因电泳图 2 菌落菌落PCR鉴定电泳图鉴定电泳图 3 重组载体双酶切鉴定电泳图重组载体双酶切鉴定电泳图结果结果 4不同温度诱导时不同温度诱导时Hla的表达情况的表达情况 5 不同温度诱导下不同温度诱导下Hla的表达形式的表达形式结果结果2.2 uiQkChange法对法对hla基因进行定点突基因进行定点突变变6 6野生型野生型hla基因序列和突变型基因序列和突变型hla序列序列 结果结果u2.3 重组重组Hla蛋白和突变蛋白和突变Hla蛋白的纯化蛋白的纯化 7 7亲和层析收集蛋白电泳亲和层析收集蛋白电泳图图 8 Hla在在Resource S离子交换柱上的色谱图离子交换柱上的色谱图9 Resource S离子交换后离子交换后Hla电泳图电泳图 10 Hla在在Superdex 75柱的色谱图柱的色谱图 11 过过Superdex 75柱后柱后Hla电泳图电泳图结果结果2.4 Hla与黄芩苷结合常数与黄芩苷结合常数12 黄芩苷与野生型黄芩苷与野生型Hla和两种突变体和两种突变体Hla相互作用的荧光光谱相互作用的荧光光谱结果结果2.5 SDS-PAGE观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的导的Hla寡聚体形成的影响寡聚体形成的影响13 黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla 寡聚体形成影响寡聚体形成影响 14 黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷阻碍黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷阻碍Hla七七 聚体形成能力的比较聚体形成能力的比较结论结论1 通过定点残基突变试验，表达和纯化了野生型通过定点残基突变试验，表达和纯化了野生型Hla和突变体和突变体Hla（Y148A、P151A和和F153A）；）；2 通过荧光淬灭试验，测定了黄芩苷与野生型通过荧光淬灭试验，测定了黄芩苷与野生型Hla及三种突变体及三种突变体Hla（Y148A、P151A和和F153A）的结合常数。结果表明，黄芩）的结合常数。结果表明，黄芩苷与三种蛋白结合力大小顺序为：野生型苷与三种蛋白结合力大小顺序为：野生型 F153A P151A Y148A，与我们在第二章中理论模拟的结果一致；，与我们在第二章中理论模拟的结果一致；3 通过脱氧胆酸诱导的通过脱氧胆酸诱导的Hla寡聚化试验考察了黄芩苷对寡聚化试验考察了黄芩苷对Hla七聚体七聚体形成的影响，结果表明黄芩苷剂量依赖性地阻碍形成的影响，结果表明黄芩苷剂量依赖性地阻碍Hla七聚体的七聚体的形成；此外，还比较了相同浓度的黄芩苷、汉黄芩苷及野黄芩形成；此外，还比较了相同浓度的黄芩苷、汉黄芩苷及野黄芩苷对苷对Hla七聚体形成的影响，结果显示其抑制能力的大小为：七聚体形成的影响，结果显示其抑制能力的大小为：黄芩苷黄芩苷 汉黄芩苷汉黄芩苷 野黄芩苷，与第二章模拟的结果一致；野黄芩苷，与第二章模拟的结果一致；4 通过纯化通过纯化Hla溶血试验比较了黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷对溶血试验比较了黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷对Hla溶血活性的影响，黄芩苷抗溶血活性的影响，黄芩苷抗Hla的的IC50为为6.63g/ml，汉黄，汉黄芩苷则为芩苷则为10.27 g/ml，而野黄芩苷对，而野黄芩苷对Hla的溶血活性几乎没有的溶血活性几乎没有抑制作用。抑制作用。在论文付梓之际，我在在论文付梓之际，我在此向各位关心此向各位关心帮助帮助支支持我的老师同学和朋友致持我的老师同学和朋友致以最真挚的谢意！是他们以最真挚的谢意！是他们的支持和辛劳才使我顺利的支持和辛劳才使我顺利完成多年的学业！谢谢！完成多年的学业！谢谢！