[中医中药]中药保肝作用及机理研究的思路与方法.ppt

中药保肝作用及机理研究中药保肝作用及机理研究的的思路与方法思路与方法 药效物质基础及作用机理是中药药效物质基础及作用机理是中药及中药复方及中药复方研究的研究的核心，也是中药现代化的关键。但由于中药化学成分的核心，也是中药现代化的关键。但由于中药化学成分的复杂性，以及有效成分对机体作用的协同性，研究十分复杂性，以及有效成分对机体作用的协同性，研究十分困难，目前还没有一种理想的研究方法，已成为制约中困难，目前还没有一种理想的研究方法，已成为制约中医药现代化发展公认的瓶颈问题。寻找适于中药复杂体医药现代化发展公认的瓶颈问题。寻找适于中药复杂体系的研究方法，阐明中药药效物质基础系的研究方法，阐明中药药效物质基础及作用机理及作用机理，一，一直是中药研究的关键科学问题，已列入国家中长期科学直是中药研究的关键科学问题，已列入国家中长期科学和技术发展规划纲要、和技术发展规划纲要、“重大新药创制重大新药创制”科技重大专项科技重大专项和中医药创新发展规划纲要相关领域和主题的重要内容。和中医药创新发展规划纲要相关领域和主题的重要内容。中药药效物质基础及作用机理研究的意义中药药效物质基础及作用机理研究的意义对于中药药效物质基础对于中药药效物质基础有多种提法有多种提法，如：，如：n有效部位群有效部位群n活性物质群活性物质群n功能组分集功能组分集n有效成分组有效成分组n有效组合成分（部位）有效组合成分（部位）n有效部分有效部分n有效系统有效系统对中药药效物质基础的认识对中药药效物质基础的认识实质实质都是有效成分的组合，即都是有效成分的组合，即中药中药发挥疗效的不是单个或几发挥疗效的不是单个或几个有效成分，而是多种成分，个有效成分，而是多种成分，这些成分可能属于不同的化学这些成分可能属于不同的化学类型，也可以是不同的作用机类型，也可以是不同的作用机制物质，通过不同途径实现协制物质，通过不同途径实现协同作用，达到治疗疾病的目的同作用，达到治疗疾病的目的。有效成分组有效成分组更能反映中药有效更能反映中药有效成分存在的状况。成分存在的状况。所谓有效成分组，是指所谓有效成分组，是指中药中药所含有的所有与临所含有的所有与临床应用目的密切相关的药理活性成分。有效成分组床应用目的密切相关的药理活性成分。有效成分组不是中药的有效部位，也不是有效组分，更不是独不是中药的有效部位，也不是有效组分，更不是独立的有效成分。有效部位、有效组分或有效成分，立的有效成分。有效部位、有效组分或有效成分，通常是指独立的一部分，这些成分并不能代表中药通常是指独立的一部分，这些成分并不能代表中药的全部药理作用，中药发挥作用的成分往往存在于的全部药理作用，中药发挥作用的成分往往存在于多个部位或多个组分中，而且同一个部位或组分中多个部位或多个组分中，而且同一个部位或组分中可能也含有非有效成分，因此，有效成分组是指复可能也含有非有效成分，因此，有效成分组是指复方中含有的全部有效成分，而不考虑所分布的部位。方中含有的全部有效成分，而不考虑所分布的部位。对中药药效物质基础的认识对中药药效物质基础的认识中药药效物质基础的研究，应涉及制剂制备过程、消化中药药效物质基础的研究，应涉及制剂制备过程、消化道运行过程、菌丛对化学物质的影响、体内转运代谢，道运行过程、菌丛对化学物质的影响、体内转运代谢，从而阐明有效成分的生成、吸收、分布、代谢的全过程。从而阐明有效成分的生成、吸收、分布、代谢的全过程。对中药药效物质基础的认识对中药药效物质基础的认识中药有中药有效成分效成分的来源的来源药材固有的药材固有的化学成分化学成分加工炮制和加工炮制和煎煮过程的煎煮过程的产物产物肠内菌代谢肠内菌代谢产物产物吸收入血进吸收入血进入肝脏经入肝脏经“首过效应首过效应”的代谢产物的代谢产物简简化化处处理理相关性分析相关性分析三个化学层次三个化学层次成分分析成分分析药理试验药理试验四个药理水平四个药理水平一个一个结合结合研研究究结结果果两两个个基基本本说说清清中药及复方中药及复方还原性验证还原性验证讲清复方中有效的化学讲清复方中有效的化学成分成分；讲清复方中有效讲清复方中有效化学成分所起的治疗作化学成分所起的治疗作用用药物药物有效部分有效部分化学成分化学成分整体动物实验整体动物实验组织器官组织器官细胞亚细胞细胞亚细胞分子生物学分子生物学中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法中药及复方中药及复方化学分离法化学分离法生物筛选法生物筛选法（血清药理学等）（血清药理学等）拆方研究拆方研究仿生筛选法仿生筛选法Caco-2细胞模型细胞模型生物色谱生物色谱 简化处理方法简化处理方法中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法生物色谱生物色谱是将活性生物大分子（酶、受体、传输蛋白是将活性生物大分子（酶、受体、传输蛋白等）、活性细胞膜、甚至活细胞等固着于色谱担体上作等）、活性细胞膜、甚至活细胞等固着于色谱担体上作为固定相的一种新兴色谱技术。这种色谱系统能够模仿为固定相的一种新兴色谱技术。这种色谱系统能够模仿药物与生物大分子、靶体或细胞之间的特异性、立体选药物与生物大分子、靶体或细胞之间的特异性、立体选择性相互作用，可以排除大量非作用杂质成分的干扰，择性相互作用，可以排除大量非作用杂质成分的干扰，为中药有效成分的筛选及作用机制的阐明提供了全新的为中药有效成分的筛选及作用机制的阐明提供了全新的思路和方法。根据作为固定相的生物活性物质的不同，思路和方法。根据作为固定相的生物活性物质的不同，生物色谱法又分为分子生物色谱法、生物膜色谱法（或生物色谱法又分为分子生物色谱法、生物膜色谱法（或仿生物膜色谱法仿生物膜色谱法）、细胞生物色谱法等。另外还建立了、细胞生物色谱法等。另外还建立了细胞膜特异性结合中药提取液中成分并加以分析的细胞细胞膜特异性结合中药提取液中成分并加以分析的细胞膜固相色谱。膜固相色谱。中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法常用肝损伤整常用肝损伤整体动物模型体动物模型四氯化碳四氯化碳肝损伤模型肝损伤模型刀豆蛋白刀豆蛋白A(ConA)急急性肝损伤模型性肝损伤模型酒精性肝酒精性肝损伤模型损伤模型急性酒精性急性酒精性肝损伤模型肝损伤模型 亚急性酒精性亚急性酒精性肝损伤模型肝损伤模型 -萘异硫氰酸萘异硫氰酸酯酯(-ANIT)肝肝损伤模型损伤模型中药保肝作用及机理研究中药保肝作用及机理研究的的思路与方法思路与方法常用肝细胞常用肝细胞损伤模型损伤模型四 氯 化 碳四 氯 化 碳（CCL4）诱 导 的 肝 细诱 导 的 肝 细胞损伤模型胞损伤模型双氧水双氧水（H2O2）诱）诱导 的 肝 细 胞导 的 肝 细 胞损伤模型损伤模型卡介苗（卡介苗（BCG）联 合 脂 多 糖联 合 脂 多 糖（LPS）诱导）诱导的肝细胞免疫的肝细胞免疫性损伤模型性损伤模型硫 代 乙 酰 胺硫 代 乙 酰 胺（TAA）诱）诱导的肝细胞损导的肝细胞损伤模型伤模型中药保肝作用及机理研究中药保肝作用及机理研究的的思路与方法思路与方法基于成分分离的中药保肝作用及机理研究基于成分分离的中药保肝作用及机理研究 单味中药的药效物质基础研究较中药复方要相单味中药的药效物质基础研究较中药复方要相对容易，可以按照前面讲到从三个化学层次，四个对容易，可以按照前面讲到从三个化学层次，四个药里水平，采用化学分离和药效跟踪相结合的方法药里水平，采用化学分离和药效跟踪相结合的方法对中药药效物质基础进行研究。下面以对中药药效物质基础进行研究。下面以“赤芍保肝赤芍保肝退黄药效物质基础研究退黄药效物质基础研究”为例对这一方法进行探讨。为例对这一方法进行探讨。赤芍赤芍中的化学成分以中的化学成分以单萜及其苷类单萜及其苷类为主，为主，总称总称赤芍总赤芍总苷苷，其中，其中芍药苷、芍药内酯苷芍药苷、芍药内酯苷含量较高。含量较高。此此外，还含外，还含有丹皮酚、三萜类、酚及其苷类有丹皮酚、三萜类、酚及其苷类、甾醇及其苷类、鞣甾醇及其苷类、鞣质、黄酮类、挥发油等质、黄酮类、挥发油等。AlbiflorinOOHOH2CCOHOCH2OHOHOOHOHPaeoniflorinOCHOOHOH2CCOHOCH2OHOHOHOH基于成分分离的中药保肝作用及机理研究基于成分分离的中药保肝作用及机理研究总体方案设计图总体方案设计图活性组分筛选活性组分筛选3个组分药效试验比较个组分药效试验比较HPLC法法同时测定同时测定芍药苷、芍药苷、芍药内酯芍药内酯苷含量方苷含量方法建立及法建立及应用应用活性部位成分分析和组分分离活性部位成分分析和组分分离n醇提部位与水提部位的含量测定醇提部位与水提部位的含量测定n大孔树脂从醇提部位分离赤芍总苷大孔树脂从醇提部位分离赤芍总苷n醇提部位醇提部位3个组分分离个组分分离活性组分及其主要成分作用机理研究及药效验证活性组分及其主要成分作用机理研究及药效验证n赤芍总苷对小鼠胆汁分泌、戊巴比妥钠睡眠时赤芍总苷对小鼠胆汁分泌、戊巴比妥钠睡眠时间及间及UDPG-T活性的影响；活性的影响；n芍药苷的保肝退黄作用评价芍药苷的保肝退黄作用评价小鼠肝小鼠肝内胆汁内胆汁淤积黄淤积黄疸模型疸模型复制复制活性部位初筛选活性部位初筛选醇提部位与水提部位药效试验比较醇提部位与水提部位药效试验比较u试验用药制备试验用药制备赤芍饮片赤芍饮片70乙醇回流提取乙醇回流提取回流液回流液水提部位水提部位回收乙醇并浓缩回收乙醇并浓缩干燥后加水煎煮并浓缩干燥后加水煎煮并浓缩药渣药渣醇提部位醇提部位uHPLC测定两部位中芍药苷、芍药内酯苷含量测定两部位中芍药苷、芍药内酯苷含量一、一、赤芍保肝退黄活性部位初步筛选赤芍保肝退黄活性部位初步筛选 醇提部位与水提部位药效试验比较醇提部位与水提部位药效试验比较基于成分分离的中药保肝作用及机理研究基于成分分离的中药保肝作用及机理研究ICR小鼠小鼠正常正常对照组对照组模型模型对照组对照组醇提醇提部位部位低剂低剂量组量组中剂中剂量组量组高剂高剂量组量组水提水提部位部位低剂低剂量组量组中剂中剂量组量组高剂高剂量组量组生理盐水灌胃CCL4造模造模CCL4造模，药物干预造模，药物干预u观察指标观察指标血清学指标：血清学指标：总胆红素总胆红素(TBIL)、直接胆红素、直接胆红素(DBIL)、总胆汁酸总胆汁酸(TBA)、丙、丙 氨酸转氨酶氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶(ALP)。肝组织病理变化半定量分析肝组织病理变化半定量分析u统计学处理统计学处理数据以数据以 xs表示，使用表示，使用wstata7.0统计软件包进行单因素方差分析，组统计软件包进行单因素方差分析，组间比较采用间比较采用Scheffe法检验，以法检验，以P0.05为显著性判断界值。为显著性判断界值。ccbaaacaP0.01 vs normal group；bP0.01，cP0.05 vs model group（以下所有柱形图均同）（以下所有柱形图均同）080160240320400正常组正常组模型组模型组醇提低醇提低醇提中醇提中醇提高醇提高水提低水提低水提中水提中水提高水提高TBILDBILTBA小鼠血清小鼠血清TBIL、DBIL及及TBA测定结果（测定结果（xs，n=10）u结果结果cbbaaabcbcb0450900135018002250正常组正常组模型组模型组醇提低醇提低醇提中醇提中醇提高醇提高水提低水提低水提中水提中水提高水提高ALTASTALP小鼠血清小鼠血清ALT、AST及及ALP测定结果（测定结果（xs，n=10）ABCD醇提部位和水提部位对胆汁淤积肝损伤小鼠肝组织的影响醇提部位和水提部位对胆汁淤积肝损伤小鼠肝组织的影响（HE300倍）倍）A-正常对照组正常对照组B-模型对照组模型对照组C-醇提部位中剂量组醇提部位中剂量组D-水提部位中剂量组水提部位中剂量组048121620正常组正常组模型组模型组醇提低醇提低醇提中醇提中醇提高醇提高水提低水提低水提中水提中水提高水提高肝组织病理