高效液相色谱检测血液CD38酶活性方法的建立.docx

高效液相色谱检测血液CD38酶活性方法的建立摘要目的建立高效液相色谱(HPLC)测定血液烟酰胺腺喋吟二核昔酸(NAD)主要消耗酶CD38酶活性的方法，检测CD38酶活性在不同年龄和健康状态人群中的差异。方法选择50PI全血作为检测样本、1501浓度为500mol/L的B-NAD为酶反应底物，全血预孵育消耗掉内源性B-NAD后，加入底物，在37OC温育40min,高氯酸(PCA)终止反应，HPLC测定酶促反应前后产物烟酰胺(NAM)变化量并计算CD38酶活性。评价方法的线性、检测限、定量限、精密度、回收率和稳定性等。用所建方法检测60名健康体检者和30名结直肠癌患者血液CD38活性。结果37预孵育20min可消除内源性B-NAD的影响。NAM在浓度为0.3.2mol/L的范围内线性良好，r=0.999,检测限为0.5nmolL,定量限为2.1nmol/Lo平均批内精密度(CV)和总CV分别为3.22%4.03%、2.91%4.70%。加样回收率在94.82%96.81%。全血在4放置48h、室温放置8h、冻存全血融化后室温放置2h以及反复冻融3次均不影响CD38酶活性。NAM、B-NAD标准品和前处理后的样本在4七放置48h、室温放置8h均可保持稳定。CD38活性随加入的CD38抑制剂4-氨基喳琳衍生物78c的浓度升高而逐渐降低。60例健康体检者结果显示，老年组CD38酶活性高于青年组(t=-2.776,P=O.007),30例结直肠癌患者CD38酶活性高于健康体检者(t=-2.572,P=O.012)。结论本研究建立的HPLC测定CD38酶活性的方法简单高效、准确性高、重复性好，为衰老及衰老相关疾病的研究提供了技术手段。CD38(EC：3.2.2.6)是具有单个跨膜结构的糖蛋白，在红细胞、免疫细胞、内皮细胞中普遍存在1,2,3,4,主要位于细胞膜上，但最新研究证实CD38也分布在细胞核和线粒体膜上，并且可能存在可溶性形式5,6,7oCD38是广泛分布于多种组织中的一种多功能酶，主要功能是消耗体内烟酰胺腺喋吟二核昔酸(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD),在NAD分解代谢及维持体内NAD稳态中发挥重要作用。NAD是氧化还原反应的重要辅酶和能量代谢的中心，其水平变化与衰老及衰老相关疾病，如肿瘤、代谢性疾病、神经退行性病变等的发生发展密切相关8,9,10o研究报道，CD38在决定细胞内NAD水平方面起着至关重要的作用,CD38-/-小鼠的NAD水平比野生型高1020倍11。CD38酶活性在衰老和肿瘤等衰老相关疾病的人群中亦有差异5,6,7,12,NAD水平降低可能主要由于CD38活性增强所致5。因此考虑到CD38在许多疾病和临床实践中发挥的关键作用，建立CD38酶活性测定方法不仅可帮助预测机体衰老和衰老相关疾病进程，其异常变化还能够揭示疾病进展中可能涉及的机制，对于生物化学机制研究和开发衰老及衰老相关疾病的干预措施具有重要意义。相比测定CD38含量等定量方法，测定CD38酶活性能够更好地反映其生物学功能。现有的CD38酶活性测定方法包括酶循环法、薄层色谱法、荧光光度法等，具有操作繁琐、需要放射性同位素、准确度较低等缺点1,10,13o通过高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLO测定酶反应底物降低或产物生成来反映酶活性可能是更好的酶活性检测策略。但目前已有的HPLC法也存在一些问题，如样本基质多为细胞14或组织15；酶促反应时间较长（218h）14,采用多个时间点12,15来计算酶活性；以及采用梯度洗脱12,15,分离时间较长等。本研究对检测样本基质、酶反应底物和反应体系进行了仔细的研究，在此基础上建立了一种简便、可靠的HPLC测定CD38活性的方法，用此方法测定了60名健康体检者和30名结直肠癌患者的CD38活性进行初步应用。材料与方法一、仪器与试剂Agilent1200高效液相色谱仪；SymmetryShieldRP18色谱柱(5m,4.6mm×150mm,美国WaterS公司)；ThernIoSCientifiC恒温水浴锅(美国ThernIo公司)；国产VOrteXKylin-Bell涡旋混匀仪等。B-NAD和烟酰胺(niacinamide,NAM)标准品购自美国Sigma公司，有机溶剂乙月青为色谱纯，购自美国FisherScientific公司,化学试剂高氯酸(perchloricacid,PCA)、磷酸盐为分析纯试剂，购自上海阿拉丁试剂公司。二、实验原理与酶活性定义B-NAD为体内参与氧化还原反应重要的辅酶，可直接或间接影响许多关键的细胞功能，其含量主要受CD38酶的调节8o在CD38酶的作用下，B-NAD可被降解生成二磷酸腺昔核糖(adenosinediphosphateribose,ADPR)和NAM9,如图1所示,且上述三者均有较强的紫外吸收。用HPLC法检测产物NAM,标准曲线外标法定量，通过NAM的生成量来确定CD38酶的活性。CD38酶活性定义为每毫升全血每秒钟产生的NAM的摩尔数，单位为nmolml-1sT,简称活性单位U。-NADADPRNAM士B*Dt!K例l“a二SE在与工ADPR力二B9NAMmV图1CD38酶促反应式三、方法1.样本基质的选择和反应条件的优化：为选择合适的样本基质，分别在血浆、新鲜全血和冻存全血中加入1501浓度为500Hmol/L的反应底物B-NAD,温育0、5、10、20、40、60min后，观察底物消耗或产物生成随温育时间的变化；为排除内源性B-NAD对酶活性测定的影响,添加B-NAD前采取预孵育的方法消耗内源性底物。全血温育0、5、10、20、40、60min后测定B-NAD含量，确定内源性B-NAD消耗完全所需要的时间；为确定反应体系中酶与底物的比例，分别配制全血与500mol/LB-NAD为1：3、1：6、1：9的反应体系，温育0、5、10、20、40、60min后测定产物NAM的生成量。2.样本处理：全血室温融化15Inin后，37OC预孵育20min以消耗内源性B-NAD。同一份全血样本分别取50Pl分装于两管，均加入500Hinol/L的B-NAD标准溶液150I0用涡旋仪充分混匀后，其中一管立即加入40010.8mol/L的PCA终止反应，另一管置于37七水浴中温育40min后加入4001PCA终止反应。48000rpm离心10min,用加样器吸取上清液1501,加入600HINa2HP04,混匀、转移至进样瓶中。3.HPLC分析:采用Agilent1200系列HPLC-UV系统检测酶反应产物NAM的生成量。色谱条件为：C18反相色谱柱(WatersSymmetryShieldRP18),流动相为0.1mol/LNaH2P04水溶液和乙月青(97:3,V/V),等度洗脱，检测波长为260nm,流速1mlmin,进样体积为20口1。4.NAM的标准曲线：采用二倍数稀释法将NAM标准溶液(3.2mol/L)逐级稀释制备浓度为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1mol/L的标准系列溶液，按照上述测定方法，以NAM的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，计算酶反应体系中的NAM05.精密度：采用变异系数(coefficientofvariation,CV)评价精密度。测量低、中、高三个水平的质控全血批内(单日中连续检测3次)和批间(连续3日进行检测)检测结果的CV,分别计算批内CV和总CV。6.回收率：分别采用0.5、1.0、2.0IInlol/L的NAM标准品加入全血中进行回收实验，测定实际浓度，理论浓度为实际添加NAM的浓度，相对回收率计算公式为：7.稳定性：为了考察全血在不同温度下放置不同时间的稳定性，抽血后立即分装全血，分别在4P放置0、1、2、4、8、24、48h,室温放置0、0.5、1、2、4、8h,冻存全血融化后室温放置0、0.5、1、2h,到达放置时间后即贮存于-80ClC冰箱。用所建立的HPLC方法检测不同贮存条件下的全血CD38酶的活性。另考察全血反复冻融13次对CD38酶活性测定的影响。为了考察标准品的稳定性，分别将0.4HmoI/LNAM和15molLB-NAD标准品在4放置0、1、2、4、8、24、48h,室温放置0、0.5、1、2、4、8h后再贮存于-80OC冰箱，HPLC检测其峰面积变化。为了考察进样稳定性，在前处理后将样本在4OC放置0、1、2、4、8、24、48h,室温放置0、0.5、1、2、4、8h后再用HPLC检测NAM和酶活性。8.CD38抑制剂4-氨基喳啾78c对CD38酶活性测定的影响：配制不同浓度（0、0.73、7.3、73、365、730、3650、7300、21900、45900nmolL）CD38抑制剂78c溶液,分别测定含不同浓度78c的反应体系中CD38酶的活性。9.CD38酶活性临床样本测定：2022年11月招募北京医院年龄为<30岁（青年组）和260岁（老年组）各30名表观健康体检者和30例未行治疗的新发结直肠癌患者，采集清晨空腹静脉血2nd,-80保存，用所建方法测定样品CD38活性。本研究获得北京医院伦理委员会批准（2022BJYYEC-062-02）,受试人员均签署知情同意书。10.统计学分析：用MicrosoftOfficeExcel2021软件分析所建方法的线性、精密度等。用SPSS26.0软件分析60例健康人和30例结直肠癌患者数据，Shapiro-Wilk检验显示数据为正态分布，独立样本t检验比较两组间差异，双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果一、反应体系的选择与优化在血浆和全血中分别添加内源性底物B-NAD37t3C温育60min,测定底物B-NAD与产物ADPR和NAM水平，三者之间的相关性如表1所示。在全血中，底物B-NAD与产物ADPR和NAM的水平具有强负相关关系(相关系数r分别为-0.9916和-0.9912),产物ADPR和NAM水平呈强正相关关系(r=0.9993)；而在血浆中，产物之间具有较好的正相关关系(r=0.9302),但产物ADPR和NAM与底物之间相关性较差(r分别为-0.8944和-0.6824)O此外，如图2所示，在全血中加入底物B-NAD温育后底物B-NAD随酶促反应时间延长呈线性降低(r=0.9978),产物NAM随酶促反应时间延长呈线性升高(r=0.9995),产物ADPR随酶促反应时间延长呈线性升高(r=0.9956)o在血浆中加入底物B-NAD温育后各底物或产物随酶促反应时间变化的趋势与全血中一致，但线性较全血中差(B-NAD、NAM和ADPR的随时间变化的线性相关系数r分别为0.9897、0.7186和0.9820)。因此本研究选择全血作为样本基质，选择酶反应产物NAM进行测定，设计酶反应体系。Sl全血和血浆笃质中反应60mln后产物ADpR和NAM与底物B-NAD水平的相关性KNADADPRNAMBNAD1-0.99160.9912ACf>R-0.991610.9993NAM0.99120.99931AK-NAD10.8944-0.6824ADPR-094410.9302NM-0.68240.93021注：BNAD力»f好二瀛音第，ADK力二BWer音福.MAMR三1 OOOf=0. 997 8sv)忠R>QVNAOo 8O 1020