法医DNA分型.ppt

第第17章章 法医法医DNA分型分型（供医学专业本科教学用）（供医学专业本科教学用）l1995年以前，北京市公安局的法医检验年以前，北京市公安局的法医检验大多是通过化验血型，如现场出现的嫌大多是通过化验血型，如现场出现的嫌疑人血型是疑人血型是O，就确定能够排除血型为，就确定能够排除血型为A、B等血型的嫌疑人等血型的嫌疑人 l现在，多项现在，多项DNA检验技术用于常规办案，检验技术用于常规办案，所有送到实验室的案子都需要进行所有送到实验室的案子都需要进行DNA的检验。的检验。染色体微带襻环30nm螺线管11nm染色质小纤维双链单链l 在发现了在发现了DNA的双螺旋结构后的双螺旋结构后,即逐渐开始了对所有核酸即逐渐开始了对所有核酸单链上单链上DNA序列的研究序列的研究l 方法方法:酶切（酶切（RFLP等）等）;杂交分析（如杂交分析（如FISH、放射性杂交等）、放射性杂交等）直接测序直接测序 l 获得的结果：获得的结果：tctagagaga accatccttc agaaaggtta ctcttcctga gacaagtctg actgtcagtt tatgttctaa gcatgtctgt gtggccagta cattcagagt ggacagtctc tgagctgtta tctttccag agagggctct ctattcagat ggtagtggaa tagagtattc aaaacataca tgttattcag agggtgagaa atatctttat cttttcccg tgctttcttc ttggcctgga aacaaatctc ctgtttacgc ttcgatttga tcagactttg aatgtgtgtg aacatgattg atgagaggct aaaaaagcc tcccaaaact caggagaggg ggaatctgtt cttagcccac ttctgacaaa tatcaatatc tgcttcctcc ccattgggat gctcctcaga caagggttaa l特点如下：特点如下：核核DNA有有30亿个碱基，胞浆亿个碱基，胞浆DNA有约有约1万多个碱基；万多个碱基；能编码基因的能编码基因的DNA占占20%，不能编码基因的，不能编码基因的DNA占占80%；编码序列中；编码序列中,仍有仍有90%不表达。即能表达不表达。即能表达的基因序列不到全基因组的的基因序列不到全基因组的2%，凡不能表达的序，凡不能表达的序列被称为列被称为“垃圾序列垃圾序列”在人基因组的在人基因组的“垃圾序列垃圾序列”中，中，35%-45%是重复是重复序列。序列。假如基因组是一部电视剧，那么只有假如基因组是一部电视剧，那么只有2 2分钟的正经节目，分钟的正经节目，却有却有9898分钟的广告！分钟的广告！人类基因组序列特点（人类基因组序列特点（3 3）人类基因组人类基因组 核基因组核基因组3000Mb 线粒体基因组线粒体基因组16.6kb 结构基因结构基因 基因间序列基因间序列假基因假基因调控基因调控基因内含子内含子串联重复串联重复散在重复散在重复 非编码区非编码区DNA 单拷贝单拷贝DNA 重复序列重复序列DNA 编码区编码区DNA 20%80%10%90%40%60%从遗传角度来讲，除同卵孪生子从遗传角度来讲，除同卵孪生子外每个人的外每个人的DNADNA分子都不一样。具体分子都不一样。具体体现在编码区序列的不同和重复序列体现在编码区序列的不同和重复序列中重复次数的差异。中重复次数的差异。从遗传角度来讲，除同卵孪生子从遗传角度来讲，除同卵孪生子外每个人的外每个人的DNADNA分子都不一样。具体分子都不一样。具体体现在编码区序列的不同和重复序列体现在编码区序列的不同和重复序列中重复次数的差异。中重复次数的差异。同一个体体内各种有核细胞都是同一个体体内各种有核细胞都是由同一受精卵分裂而来，故在同一个由同一受精卵分裂而来，故在同一个体中各种有核细胞内所含的体中各种有核细胞内所含的DNADNA都是都是一样的。一样的。作为基因载体的作为基因载体的DNADNA分子分子 不同个体中的独特性不同个体中的独特性 同一个体中的统一性同一个体中的统一性 作为基因载体的作为基因载体的DNA分子分子 不同个体中的独特性不同个体中的独特性 同一个体中的统一性同一个体中的统一性 法医法医DNA分析技术正是利用了分析技术正是利用了DNA所所具有的这两个特性，通过对生物检材中具有的这两个特性，通过对生物检材中DNA遗传多态性的检验进行个人识别和亲遗传多态性的检验进行个人识别和亲权鉴定。权鉴定。当前成熟的法医当前成熟的法医DNA分型，主要是利分型，主要是利用对重复序列的分析达到个人识别的。用对重复序列的分析达到个人识别的。二、最有价值的重复序列：二、最有价值的重复序列：STR（Short Tandem Repeats）位点）位点l重复序列在高等生物基因组中普遍存在重复序列在高等生物基因组中普遍存在,越高等的动物越高等的动物其重复序列就越多其重复序列就越多l在人基因组的在人基因组的“垃圾序列垃圾序列”中，中，35%-45%是重复序列。是重复序列。l如第如第7号染色体中，重复序列占号染色体中，重复序列占57%；在人的每一条染；在人的每一条染色体末端，存在一段色体末端，存在一段6个碱基（个碱基（TTAGGG）的重复序）的重复序列，它重复了大约列，它重复了大约2501500次次l 分为简单重复和串联重复两大类分为简单重复和串联重复两大类 简单重复：如简单重复：如“CG”组合在人类基因组中到处存在，组合在人类基因组中到处存在，散在分布，共有近散在分布，共有近3万个万个CG；如；如“CA”重复、重复、“GT”重复等重复等 串联重复：如第串联重复：如第7号染色体上的一段序列，其核心号染色体上的一段序列，其核心序列为序列为GATA，重复多次，形成，重复多次，形成 GATA GATA GATAGATA GATA GATA GATA GATA GATA l核心序列短（为核心序列短（为2-6个碱基）个碱基）l重复次数少（一般重复重复次数少（一般重复8-40次）次）l加上其加上其5和和3端的侧翼序列端的侧翼序列,整个整个STR位点长位点长100-300bp左右左右,易于分析易于分析l在人基因组中广泛存在，染色体定位明确在人基因组中广泛存在，染色体定位明确l分析结果简单分析结果简单,直接获得其重复次数直接获得其重复次数,易于命名。易于命名。如案例中嫌疑人袁如案例中嫌疑人袁*的的D8S1179位点的等位基位点的等位基因分别为因分别为13、15，即其核心分别重复了，即其核心分别重复了13、15次次l遵循孟德尔规律遗传，如果父亲的两个等位基遵循孟德尔规律遗传，如果父亲的两个等位基因为纯合子即因为纯合子即15，15，那么他必将其中之一传，那么他必将其中之一传递给他的孩子递给他的孩子l不同不同STR位点核心序列不同，重复次数也不同位点核心序列不同，重复次数也不同 如如D8S1179位点，张三的重复次数可能为位点，张三的重复次数可能为12，12，而李四，而李四的重复次数可能为的重复次数可能为10，15；又如又如D21S11位点，张三的重复次数可能为位点，张三的重复次数可能为28，30，而李四，而李四的重复次数可能为的重复次数可能为29，31l如本案例中各分型结果：在受害者和嫌疑人之间，如本案例中各分型结果：在受害者和嫌疑人之间，只是在只是在D16S539一个位点上完全一致一个位点上完全一致D8S1179 D21S11 D7S820 D16S539 D18S51 胎儿 13，1428，31 10,11 10,12 14,16 受害者10，1428，30 8,10 10,12 13,16 嫌疑人13，1529，3111,12 10,12 14,16 l如此分析多个个体的多个如此分析多个个体的多个STR位点，则位点，则不同个体间分型结果完全一致的几率极不同个体间分型结果完全一致的几率极小小l联合分析多个这样的位点，则完全可以达到联合分析多个这样的位点，则完全可以达到个人识别的能力个人识别的能力l计算结果表明，计算结果表明，FBI(Federal Bureau of Investigation)推荐的推荐的13个个STR位点联合分析，位点联合分析，可达到可达到99.9999%的个人识别效力的个人识别效力l分别为分别为CSF1PO、FGA、TH01、VWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11lD*：第：第*号染色体号染色体lS*：首次进入数据库的第：首次进入数据库的第*号号单拷贝原始序列单拷贝原始序列l如如D8S1179即第即第7号染色体上第号染色体上第1179个被登记的个被登记的STR序列序列三、三、STR位点的分析：位点的分析：PCR方法方法（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应聚合酶链式反应)3.1 PCR的基本原理的基本原理 在体外条件下，利用在体外条件下，利用DNA聚合酶的催化作用，以靶聚合酶的催化作用，以靶DNA作为模板，由一对引物引导作为模板，由一对引物引导DNA合成，使两引物合成，使两引物间的靶间的靶DNA片段得到特异性的扩增。片段得到特异性的扩增。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。DNA变性变性引物结合引物结合延伸延伸一次扩增一次扩增 结果结果 二次扩增二次扩增 3.1 PCR的基本原理的基本原理 在体外条件下，利用在体外条件下，利用DNA聚合酶的催化作用，以靶聚合酶的催化作用，以靶DNA作为模板，由一对引物引导作为模板，由一对引物引导DNA合成，使两引物合成，使两引物间的靶间的靶DNA片段得到特异性的扩增。片段得到特异性的扩增。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。所谓引物所谓引物(primer)是由是由DNA合成仪人工合成的与待扩合成仪人工合成的与待扩增的增的DNA片段两翼互补的寡核苷酸片段片段两翼互补的寡核苷酸片段(由几个或几十由几个或几十个碱基组成个碱基组成)。3.1 PCR的基本原理的基本原理 在体外条件下，利用在体外条件下，利用DNA聚合酶的催化作用，以靶聚合酶的催化作用，以靶DNA作为模板，由一对引物引导作为模板，由一对引物引导DNA合成，使两引物合成，使两引物间的靶间的靶DNA片段得到特异性的扩增。片段得到特异性的扩增。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。其扩增产物的特异性是由引物的序列所决定的。所谓引物所谓引物(Primer)是由是由DNA合成仪人工合成的与待扩合成仪人工合成的与待扩增的增的DNA片段两翼互补的寡核苷酸片段片段两翼互补的寡核苷酸片段(由几个或几十由几个或几十个碱基组成个碱基组成)。在进行在进行PCR时，时，DNA的合成只能在两引物之间沿待扩的合成只能在两引物之间沿待扩增的增的DNA模板进行，从而得到两条与模板模板进行，从而得到两条与模板DNA序列完序列完全互补的全互补的DNA新链。新链。3.2 PCR的反应过程的反应过程 将耐热将耐热DNA聚合酶（通常使用的是聚合酶（通常使用的是Taq DNA polymerase）、引物、脱氧核糖核苷）、引物、脱氧核糖核苷酸（包括酸（包括dATP、dCTP、dGTP和和dTTP）、）、待扩增的模板待扩增的模板DNA及提供最佳反应条件的及提供最佳反应条件的缓冲系统等按照适当的比例混合组成的反应缓冲系统等按照适当的比例混合组成的反应体系装于扩增管中。体系装于扩增管中。通过通过DNA扩增仪以不同扩增仪以不同的温度循环进行的温度循环进行扩增。扩增。每个循环周期一般包括三个基本步骤：每个循环周期一般包括三个基本步骤：模板模板DNADNA变性：即在变性：即在94940 096960 0C C高温下使模板高温下使模板DNADNA发发生热变性，打开生热变性，打开DNADNA双链。双链。每个