第十七章 流式细胞仪分析技术及应用.ppt

第十七章第十七章 流式细胞仪分析技术及应用流式细胞仪分析技术及应用第一节第一节 概述概述 一、工作原理一、工作原理 二、散射光的测定二、散射光的测定 三、荧光测量三、荧光测量 四、细胞分选原理四、细胞分选原理第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析 一、参数一、参数 二、数据显示方式二、数据显示方式 三、设门分析技术三、设门分析技术第三节第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳颗粒的应用三、免疫胶乳颗粒的应用四、流式细胞免疫学技术的质量控制四、流式细胞免疫学技术的质量控制第四节第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、五、AIDSAIDS病检测中的应用病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关六、自身免疫性疾病相关HLAHLA抗原分析抗原分析 七、移植免疫中的应用七、移植免疫中的应用思考题思考题小结小结流式细胞术流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。选的新技术。流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点流式细胞术的特点 流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、理或化学性质（如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗原等）进行快速、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。测量并可分类收集的高技术。第一节第一节 概述概述细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA,RNADNA,RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子,PH,PH值值,膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。性。一、工作原理一、工作原理 （1 1）液流系统液流系统 （2 2）光学系统光学系统 （3 3）数据处理系统数据处理系统1.流式细胞仪的基本结构：流式细胞仪的基本结构：由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成 待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的荧光染料标记的单抗对其染色单抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进从样品管进入流动室形成样本流入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统）液流系统喷嘴喷嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeam鞘液鞘液液流系统示意图液流系统示意图FCMFCM的液流系统（如的液流系统（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管 激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/短波长，通过短短波长，通过短/长长波长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：光电倍增管：FS,SSFS,SS（散射光），（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（荧光）（2）光学系统）光学系统FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统）数据处理系统基本工作原理基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程基本过程区别区别流式细胞仪流式细胞仪显微镜显微镜光源光源激光激光自然光、灯光自然光、灯光对象对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子细胞、组织等细胞、组织等承载工具承载工具鞘液及流动室鞘液及流动室载玻片载玻片检测信号检测信号光学信号光学信号形态及染色形态及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大电路、放大电路目镜目镜物镜、光学放大物镜、光学放大统计统计计算机，计算机，50005000人工，人工，200200结果结果多参数，综合分析多参数，综合分析简单，单参数简单，单参数流式细胞仪与显微镜的区别流式细胞仪与显微镜的区别 细胞在液柱中与激光束相交时细胞在液柱中与激光束相交时向周围向周围360立体角方向散射的光线立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分状、胞内颗粒折射等有关，主要分为为前向散射光前向散射光和侧向散射光侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定前向散射光前向散射光（forward scatter,forward scatter,FSFS）：激光束照射细胞时，光激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度以相对轴较小角度(0.5(0.51010)向前方散射的讯号用于检测细向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图侧向散射光（侧向散射光（side scatter,SSside scatter,SS）：）：激光束照射细激光束照射细胞时，光以胞时，光以9090角散射的讯号，用于检测细胞角散射的讯号，用于检测细胞内部内部结构属性。结构属性。FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光侧向散射光示意图示意图 测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由图，由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进行分析或分选。行分析或分选。此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。多个不同特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器三、荧光测量三、荧光测量荧光染料的特性荧光染料的特性激发波长激发波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)荧光补偿荧光补偿 通过流式细胞仪进行细胞分选通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。进一步培养和研究时进行的。四、细胞分选原理四、细胞分选原理细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理 分选速度：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。的百分率。分选收获率：分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。与分选速度成反比。（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求 参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL 数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双、双参数散点图参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维、假三维等高图等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、参数参数 单参数直方图单参数直方图 双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图 三参数直方图三参数直方图 多参数分析多参数分析直分析方图直分析方图设门分析设门分析:REGION和和GATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式 由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图（一）单参数直方图单参数直方图单参数直方图细胞相对数量细胞相对数量信道信道(channel(channel)双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。就