动物组织中氯霉素的残留测定－酶联免疫吸附法.docx
ICS备案号:DB34安徽省地方标准DB34/T821-20XX代替DB34/T821-2008动物组织中氯霉素的残留测定一酶联免疫吸附法DeterminationofchloramphenicolresidueinanimaltissuesEnzyme-Iinkedimmunosorbentassay（征求意见稿）20XX-XX-XX 实施20XX-XX-XX发布安徽省市场监督管理局发布本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。本标准代替DB34/T821-2008动物组织中氯霉素的残留测定一酶联免疫吸附法，除编辑性修改外主要技术变化如下：修改了增加了本标准由安徽省兽药饲料监察所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽省水产技术推广总站等。本标准起草人：许世富。本标准2008年8月首次发布，本次为第次修订。动物组织中氯霉素的残留测定一酶联免疫吸附法1范围本文件规定了动物肌肉、肝脏、肾脏、尿液、鱼肉、虾肉和禽(鸡、鸭)蛋中氯霉素残留量酶联免疫吸附测定方法。本文件适用于动物肌肉、肝脏、肾脏、尿液、鱼肉、虾肉和禽(鸡、鸭)蛋中氯霉素残留量的快速筛选测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理残留在物组织中的氯霉素经乙酸乙酯提取，正己烷脱脂后用于前联免疫测定。试样中的氯霉素抗原与包被于微孔板中的氯霉素特异性抗体进行免疫竞争性反应，加入一定量的显色底物和终止液，在450nm处进行吸光度测量，试样中氯霉素的含量与颜色成反比。换算后可以获得样本中氯霉素的含量。4试剂和溶液4.1 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GBb6682的二级水。4.2 竞争防标免疫法氯霉素试剂盒，2°C8°C冰箱中保存。4.2.1微孔板：包被有氯霉素抗体。4.2.2氯霉素标准溶液：浓度范围OgL0.02gL>0.06gL>0.18gL>0.54pg/L、1.62gLo4.2.3抗体工作液：1瓶(7mL)。4.2.4酹标记物工作液：1瓶(12mL)。4.2.5浓缩样品稀释液：1瓶(IoX,30mL)。4.2.6浓缩洗涤液：1瓶(20x,25mL)。4.2.7底物A液：1瓶(7mL)。4.2.8底物B液：1瓶(7mL)。4. 2.9终止液：1瓶(7mL)。4.3 乙酸乙酯。4.4 正己烷。4.5 样品稀释液：取浓缩样品稀释液(4.2.5),用水按1：9(V/V)稀释，混匀。4.6 洗涤工作液：取浓缩洗涤液(4.2.6),用水按1：19(V/V)稀释，混匀。4.7 底物A、B混合液：分别取底物A液(4.2.7)、底物B液(4.2.8),按1：1(V/V)充分混匀，在5min内使用，避免搅拌，避免使用金属容器盛装。5仪器设备5.1 酎标仪：带45Onm、630nm(或62Onm)滤光片。5. 2分析天平：感量0.01g。5.3匀浆机：IOOOOrpmo5. 4离心机：25OOOrPmo5.5 振荡器。5.6 冰箱。5.7 氮吹仪。5.8 微量加样器及配套吸头：（单道20L,50L,100L,多道50L300L）.6试样制备6.1 样品处理6.1.1 动物肌肉、肝脏、肾脏、鱼肉、虾肉动物肌肉、肝脏、肾脏，去筋膜，鱼去鳞去骨去内脏，取皮和肌肉部分，虾去头去壳去肠腺，上述样品切成小块，制成糜状，IoooOrPm均质2min,取3g±0.05g均质样品，加入6mL乙酸乙酯（4.3）,充分涡动2min,室温400Og离心IOmin,取4mL上层乙酸乙酯层于新的离心管中，50°C6（C水浴中，氮气吹干；残留物用2mL正己烷（4.4）溶解，充分涡动IOs,再加入ImL样品稀释液（4.5）,低速涡动Imin,4000g以上离心5min,完全弃去上层正己烷及中间层杂质，取50L下层水相进行测定。6.1.2禽（鸡、鸭）蛋禽（鸡、鸭）蛋，去壳，将蛋清和蛋黄搅拌均匀，取3g±0.05g均质样品，加入6mL乙酸乙酯（4.3）,充分涡动2min,室温40OOg离心IOmin,取4mL上层乙酸乙酯层于新的离心管中，50°C-60C水浴中，氮气吹干；残留物用2mL正己烷（4.4）溶解，充分涡动IOs,再加入ImL样品稀释液（4.5）,低速涡动lmin,4000g以上离心5min,完全弃去上层正己烷及中间层杂质，取50L下层水相进行测定。6.1.3尿液取0.1mL新鲜样品（冷冻或冷藏样品恢复至室温），加入到0.3mL去离子水中，涡动IOs混匀；取50L进行检测。6.2 样品贮存将试样按照测试和备用分别存放于-20°CT6条件下保存。7测定步骤7.1 测定在室温20C25°C条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温（20C25°C）下放置lh2h°7.2 按标准样品和测定样品数量，取孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。7.3 分别在各孔中加入50L标准品工作液或样品溶液，然后每孔中加入50L抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡酶标板10s,充分混匀，室温下（25±2°C）避光反应30min07.4 揭开盖板膜，倾出板孔中的液体，在所有微孔中加260L洗涤工作液（4.6）,轻轻振荡酶标板15-30S,充分混匀，倾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍干，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复洗板4遍。7.5 每孔加100L酶标记物工作液（4.2.4）,用盖板膜封板，轻轻振荡酶标板IOs,充分混匀，室温下（25±2）避光反应30min。7.6 重复步骤7.4,每孔加100L底物A、B混合液（4.7）,用盖板膜封板，轻轻振荡酶标板IOs,充分混匀，室温下（25土2）避光反应15min20min°7.7 揭开盖板膜，每孔加50L终止液（4.2.9）,轻轻振荡酶标板IOs,充分混匀，5min30min在450nm.630nm（或62Onm）下检测吸光度值。8结果判定和表述用获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算，见式（I）：按下式计算百分吸光度值：D相对吸光度值=-xl00%（1）Bo式中：B标准溶液或供试样品的吸光度值；Bo空白（浓度为0标准溶液）的吸光度值。将计算的相对吸光度值（）对应氯霉素标准溶液浓度（gL）的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。见式（2）：JT-mX100O（2）式中：X试样中氯霉素的含量，单位为微克/千克（或微克/升）（gkg或gL）；A试样的相对吸光度值（）对应的氯霉素的含量，单位为微克/升（gL）；f试样的稀释倍数；?试样的取样量，单位为克或微升（g或mL）。计算结果表示到小数点后两位。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法在动物肌肉、肝脏、肾脏、鱼肉、虾肉、禽（鸡、鸭）蛋中的检测限为0.02gkg;在动物尿液中的检测限为0.1gkg.9.2准确度本方法在25倍检测限添加浓度水平上的回收率为80%120%。9.3精密度本方法的批内变异系数CV%W10%,批间变异系数CV%W15%.10其他10.1 本方法在动物肌肉、肝脏、肾脏、鱼肉、虾肉、禽（鸡、鸭）蛋中稀释系数为0.5；在动物尿液中稀释系数为3。10.2 本方法为快速测定法，检测结果小于检测限时可判为未检出，大于或等于检测限时，应使用色谱质谱联用法进行确认。10.3 Bo吸光值不得低于0.8。10.4 试剂盒可能存在交叉反应，不同品牌的试剂盒，其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。
