丙肝病毒分子分型方法.ppt

u1975年,英国Lancet杂志首次使用非甲非乙型肝炎这个名词u1989 年,HCV cDNA 克隆成功,并正式命名HCVu1991年国际病毒命名委员会(ICTV)将HCV 归为病毒科丙型肝炎病毒属u其基因组为单股正链RNA,易变异。u全长9.6 kbu341 b的5非编码区(5NTR,NCR,UTR)u27b的3非编码区(3NRT)。u在病毒复制中,氨基酸有三个蛋白(C、E1、E2/NS1)u羧基端有4个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)HCV 基因分型分类系统u不同的研究者建立并使用各自的HCV 分类系统u主要的命名系统有:Chan系统、Simmonds 系统、Okamoto 分类系统、Kanazawa命名系统u第二届HCV 与相关病毒国际讨论会议上,制定了统一的命名系统-Simmonds系统,u目前认为主要有6种HCV基因型及不同亚型,u以阿拉伯数字表示HCV 基因型,以小写的英文字母表示基因的亚型(如1 a、2 b、3 c等)。HCV 基因型分布基因型分布北美北美:1,3,2南美南美:1,2,3欧洲欧洲:1,3,2非洲非洲:2,1,3,4,5,6亚洲亚洲:2,1,3,4,6中东中东:4中国：中国：1b，2，6HCV 基因分型区域的选择u最准确的方法就是对基因组的某个区进行PCR 扩增、测序及进化树分析,选择的区有NS5、Core、E1和5UTRu通常建立在5 UTR,因为该区是HCV RNA 诊断实验的常用区域基因分型的分子学方法测序法：测全长或片段 u金标准 u费时费力 不适于临床基因型特异性引物PCR法uOkamoto等首先采用u分型的效果仍比较差u需使用7对引物(3)型特异性探针杂交(LIPA)u将生物素或荧光素标记型特异性探针固化相化在膜或芯片u与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交u是建立在5非编码区基础上u有5%10%的1 a、1 b 型不能鉴别,u也不能区别2 a 和2 c 型。(4)限制性片段长度多态性分析(RFLP)法:u用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将PCR 扩增的片段切割成不同长度的片段u该方法常用的酶为HaeIII、RsaI、Mva I、Hinf I、Scrf Iu该方法检测基因型的精确度为97u不能区分所有的HCV基因亚型u也不能识别在泰国和越南发现的变异基因型，(5)遗传发育关系进化树u对一定区域的样本测序结束后可将序列互相比较u分析样本间序列的进化距离,画出该区域内HCV 流行的关系进化树,u观察HCV 在区域内的分子流行情况及特点（6）特异引物错配延伸法(PSMEA)：u利用taq酶在引物3末端发生错配时无法继续延伸u借助荧光测量仪检出错配峰出现的频率达到分型目的u该方法成为检测混合HCV基因型感染的方法比直接测序灵敏度高20倍异源分子迁移率法（HMA）：u用已知不同型的HCV 参比DNA 与未知基因型的HCV 的DNA 分子混合、变性、退火,形成同源、异源分子,u这些分子在PA GE 中迁移率不同,并同异源DNA 中不同碱基的数目成比例,来鉴定基因型 王林,徐东平,张灵霞.丙型肝炎病毒基因型分型及临床意义 J.肝脏2006,12:416-417.COMA基因分型法：u原理是基于长异源双链的解链特性不同用已知的序列顺序的参考DNA捕获液相中未知的DNAu两者形成异源双链杂交体，由这个杂交体的两条单链间解链曲线的差异可以推断出其序列差异Taqman探针实时PCR测试法u这一方法用到了Taqman探针(针对5 UTR)u结合荧光实时PCR应用DNA芯片技术u指将成千上万种核酸探针固定在一块指甲大小的支持物上u通过分析待测样品与芯片的杂交信号可得到大量遗传信息 施英娟基因芯片检测血清标本的丙型肝炎病毒基因型南通大学学报(医学版)，2005；25(2)：92