甲胎蛋白在非肿瘤性肝病中的研究进展王玉娇何毅怀、陈云芬、刘思颖、周依洋、李映、饶健旭、汪杰、肖雪.docx

甲胎蛋白在非肿瘤性肝病中的研究进展王玉娇I、何毅怀、陈云芬、刘思颖、周依洋、李映、饶健旭、汪杰、肖雪东【摘要】甲胎蛋白(-fetOPrOtein,AFP)在肝癌诊疗中具有重要意义，是一种具有类似于白蛋白理化性质的糖蛋白。AFP具有抗凋亡及促进细胞生长的作用，其持续升高是诊断肝细胞癌的重要线索。但是，AFP的确切生理功能仍然未知。临床上，良性肝病患者血清中AFP水平呈不同程度的一过性升高，并随病情变化而波动，可用于判断良性肝病患者肝功能衰竭的预后等，但AFP在非肿瘤性肝病中的作用及机制尚未完全探讨明确。近年AFP的分子基础、临床规律及其应用都有了更深入研究，为强调AFP在非肿瘤性肝病中越来越重要的临床作用及意义，故本文综述目前AFP在非肿瘤性肝病中的研究进展。AbstractAlpha-fetoprotein(-fetoproteinzAFP)isofgreatsignificanceinthediagnosisandtreatmentoflivercancer.Itisaglycoproteinwithphysicochemicalpropertiessimilartoalbumin.AFPhastheeffectsofanti-apoptosisandpromotingcellgrowth,anditscontinuousincreaseisanimportantclueforthediagnosisofhepatocellularcarcinoma.However,theexactphysiologicalfunctionofAFPisstillunknown.Clinically,serumAFPlevelsinpatientswithbenignliverdiseasesaretransientlyelevatedtovaryingdegreesandfluctuatewithchangesinthedisease.Itcanbeusedtojudgetheprognosisofliverfailureinpatientswithbenignliverdiseases,buttheroleofAFPinnon-tumorliverdiseasesandthemechanismhasnotyetbeenfullyexploredandclarified.Inrecentyears,themolecularbasis,clinicalrulesandapplicationsofAFPhavebeenmoredeeplystudied.InordertoemphasizetheincreasinglyimportantclinicalroleandsignificanceofAFPinnon-tumorliverdiseases,thisarticlereviewsthecurrentresearchprogressofAFPinnon-tumorliverdiseases.【关键词】甲胎蛋白；异质体；基因调控：非肿瘤性肝病；肝再生Keywords:Alpha-fetoprotein;heterogeneity;generegulation;non-tumorliverdiseases;liverregeneration1. AFP的概述甲胎蛋白(-fetoprotein,AFP)是1956年被发现，而人类胎儿体中含量最丰富的血清蛋白，水平约为300000ng/mLoAFP属于白蛋白(albumin,ALB)家族。所有这些蛋白质都具有高度的结构同源性。特别是AFP与ALB蛋白结构、分子量、等电点几乎相同，具有类似的物理化学性质，使得AFP与ALB也同样具有载体、参与调节细胞分裂代谢、免疫调节等相似功能。但ALB与AFP不同，因为它不包含寡糖部分。1.1 甲胎蛋白的来源及合成人体正常情况下主要由胚胎时期卵黄囊、胎儿时期肝和胃肠细胞产生AFP,出生后2-3月基本被ALB替代，丧失合成AFP的能力，这种转换是在转录水平上进行的。胚胎在宫内发育的第4周可测出AFP,在第12/6周达到峰值，占胎儿血浆蛋白总量的1/3,第16周，即4个月后AFP的浓度迅速下降，而ALB浓度上升。神经管缺陷、染色体异常和其他胎儿异常可以通过羊水中AFP水平升高来识别。而母体血清AFP水平在妊娠28-32周最高水平，在胎儿出生后迅速下降，通常在8-12个月时降至正常。故正常成年人的血液中AFP常常小于10ngmL,保持在较低的水平。AFP在成人循环中再次出现与肝再生、肝炎、慢性肝病和恶性生长有关，尤其是内胚层来源的肝细胞瘤、畸胎瘤和胃肠癌U2(PMID：；)。1.2AFP的蛋白结构AFP是一种特殊糖蛋白，分子量约为68kD的，结构呈V形，具有1个肽链、2条复合糖链、590个氨基酸残基，每个分子都含有3个结构域。不同组织分泌的AFP在寡糖结构、不同电荷、肽链N末端上稍有不同，称为AFP的微观不均一性，而这种结构的变异称为AFP异质体。依据AFP与扁豆凝集素(IenSCUIinariSaggIUtinin,LCA)结合能力的不同，将人体血清AFP分为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3o其中AFP-Ll主要存在于肝炎和肝硬化等非肿瘤性的肝病患者血液中；AFP-L2主要见于卵黄囊肿瘤患者及怀孕时母体的血液中；AFP-L3是一种异常糖基化AFP,为肝癌细胞特异性产生，也就是通常所说的AFP异质体。1.3AFP的产生AFP是一种分泌蛋白，由特定细胞产生，在内质网和高尔基体内加工和糖基化，然后分泌到细胞外，再结合到其他细胞发挥作用。非肿瘤性肝病中血清AFP可一过性升高，常与肝损伤的严重程度相关，被认为与肝损伤特别是比较严重的肝损伤后，肝前体细胞(如卵圆细胞、肝祖细胞)被激活、增殖、分化，AFP基因被激活，合成并分泌AFP,直至分化为成熟的肝细胞。肝前体细胞是具有双向分化潜能，即在生理条件下可分化为肝细胞，或分化为胆管细胞，参与肝再生。肝损伤较轻时主要是主要通过正常的肝细胞增殖修复肝脏，在肝炎较重则需要同时通过激活及动员肝前体细胞补偿缺损的肝细胞。而在肝衰竭中，肝细胞的增殖不良，肝脏主要是依赖肝干细胞的活化和增殖进行肝再生。1.4 AFP的基因及调控AFP基因的DNA位于4号染色体的长臂1112区，约为20k碱基对(bp)大小，由14个外显子和15个内含子组成，在N端有一个信号肽序列。AFP与ALB在基因组中保持相邻。AFP基因具有高组织特异性和表达的严格时间调控，胎儿时期、肝脏增殖再生等情况，AFP基因被激活，出生后AFP基因则停止表达。AFP由其基因上游一个高度保守的调节区精准调控,主要包括：1个启动子、3个增强子和1个沉默子。AFP水平能从胎儿300000ng/mL抑制到成人水平低于IOngmL的关键在于启动子、增强子和沉默子的共同调控。AFP水平的调节可在转录、转录后水平调控。1.4.1 启动子AFP启动子具有组织特异性，包含多个转录因子的重叠结合位点，与一些组织特异性转录因子结合，包括肝细胞核因子1(hepatocytenuclearfactor-1,HNFI)及CCAAT-增强子结合蛋白(CCAAT/enhancerbindingprotein,C/EBP)结合位点等。例如通过HNFl可以结合到的近端和/或远端启动子区域的AT基序，促进AFP基因的转录活性，激活AFPo当AFP启动子区域发生突变时，增加了与HNFl的结合亲和力，从而提高了AFP转录水平，造成遗传性持续AFP升高。HNFl结合点的突变可能通过改变HNF转录因子的结合导致AFP的异常高表达，这与更年期妇女的肝硬化密切相关(PMID：)。此外，AFP基因上游也存在糖皮质激素反应的区域，通过该区域糖皮质激素可促进AFP启动子的活性。AFP启动子的转录活性比较低，故其转录活性更多依赖于这些增强子的活性。甲胎蛋白增强子区域在肝脏发育过程中激活甲胎蛋白启动子。RNA聚合酶正确组装到启动子上需要增强子，故在体内缺乏增强子时，AFP启动子是无活性的。故增强子在AFP的转录激活中发挥了很大的作用。1.4.2 增强子AFP增强子区域是卵黄囊、胎儿肝脏和再生成人肝脏中正常AFP表达所必需的。人类目前已知有两个增强子区域，远端增强子位于转录起始位点上游的4120至3756bp处，近端增强子位于上游的3492至3300bp处。在人AFP远端上增强子有HNFl、HNF4结合位点各1个，及CZEBP结合位点2个，在近端增强子上有HNFl、HNF3结合位点各1个，及C/EBP的结合位点3个，共同调控AFP转录。C/EBP与AFP启动子位点的结合亲和力不如与增强子位点的高。当转染到产生AFP的细胞中时，这些元件中的每一种都能够以剂量依赖性方式刺激AFP启动子以及异源启动子活性。与AFP的启动子相似，增强子是肝脏组织特异性的，在肝细胞以外的多数细胞中没有活性，其组织特异性主要与HNFl特异性富集有关。存在2个HNFl和1个HNF4位点是人类而非啮齿动物AFP增强子的特征。1.4.3 沉默子沉默子在AFP增强子和启动子之间，远端沉默子位于转录起始位点的-18007300bp处，近端沉默子位于-400-200bp处。沉默子中负责负调节活动的核心序列：5'-CTTCATAACTAATACTT-3,该序列高度保守，可以强烈的抑制AFP的转录活性。这个核心序列在近端沉默子中只出现1次，而在远端沉默子中出现4次，故近端沉默子对AFP基因的调控能力远远不如远端沉默子。AFP的沉默子并不直接影响启动子的功能，而通过位置依赖性方式抑制增强子对启动子的激活减少AFP转录起始。异常的沉默子是AFP转录活性重新开启的关键。AFP在胎儿肝脏的沉默子活性很低，但在成年后的肝脏中活性则较高。人类肝癌细胞系HuH-7和huH-l/cl-2,分别产生高和低水平的AFP,我们发现huH-l/cl-2中存在沉默子区域而HuH-7无沉默子活性。这表明沉默子在正转录因子存在的情况下起作用，并且可能在出生后AFP水平明显下降的基因表达抑制中以及AFP基因在肝病的可变表达中起关键作用。1.5 AFP的生物学功能研究显示AFP具有多种生物学功能，但其确切生理功能目前尚未得到充分研究。迄今为止，已经知道了它在生长调节、免疫调节以及载体等方面的作用，本部分旨在概述AFP的几个重要功能。1.5.1 生长调节作用AFP通过不同的机制对细胞生长有多重调节作用。AFP可通过载体的作用转运雌激素、脂肪酸及胆红素等物质，改善细胞生存微环境，促进细胞生长。也可通过结合细胞膜上的受体，影响细胞对Ca?+的通透性，引起胞浆内Ca?+升而，进而通过升高细胞内CAMP浓度，激活蛋白酶A,促进细胞核酸等物质的合成，促进细胞再生。低浓度AFP通过选择性的抑制P53Baxcytochromecaspase-3信号通路阻断人肝癌细胞凋亡信号的传递，显著促进肿瘤细胞的生长。同时.，对某些细胞，AFP则存在抑制效应。通过调控淋巴细胞、巨噬细胞的免疫反应、激活凋亡信号，促进其清除。在高浓度AFP的研究中发现：高水平的AFP可诱导肿瘤细胞的程序性死亡。AFP也可作为一种有效的肿瘤细胞抑制抗原，通过刺激淋巴细胞产生特异抗体，与能分泌AFP的肿瘤细胞结合，促进其死亡。AFP具有生长调节活性。前期研究结果主要来源于肝癌细胞的研究。甲胎蛋白在肿瘤发生及发展过程中不仅仅是一种伴瘤现象，也可直接调控肿瘤细胞的生长、增殖、抵抗凋亡、侵袭及转移、化疗耐药等过程，涉及物质运输、跨膜及胞浆信号传递、受体脱敏、免疫逃逃逸、凋亡抵抗、细胞增殖等阳。肝癌细胞系中的HePG2细胞在清除结合在其细胞表面的AFP后，细胞变得对肿瘤坏死因子-（tumornecrosisfactoralpha,TNF-）的细胞毒作用敏感。AFP可以通过下调TNRa介导的细胞死亡途径，减少肿瘤细胞的清除，促进其恶性行为。