抗体技术研究及产业化.ppt

细胞表细胞表面抗原面抗原血型抗原血型抗原组织相容性组织相容性抗原抗原白细胞分化抗原白细胞分化抗原CD2CD3CD25CD10CD20CD38CD45CD71CD41CD42CD8.肿瘤相关肿瘤相关抗原抗原胃癌胃癌肺癌肺癌肝癌肝癌鼻咽癌鼻咽癌大肠癌大肠癌宫颈癌宫颈癌乳腺癌乳腺癌结肠癌结肠癌卵巢癌卵巢癌胰腺癌胰腺癌喉癌喉癌脑胶质瘤脑胶质瘤骨肉瘤骨肉瘤病毒病毒HFRSV新城疫新城疫甲肝甲肝轮状轮状登革登革乙肝乙肝RSV乙脑乙脑流感流感马雅罗马雅罗Mayaro 基孔贡亚基孔贡亚Chikungunya Ross River罗斯河罗斯河 盖塔盖塔Getah柯萨奇柯萨奇狂犬狂犬新培斯新培斯Sindbis细菌细菌大肠杆菌大肠杆菌沙门氏菌沙门氏菌痢疾杆菌痢疾杆菌军团杆菌军团杆菌结核杆菌结核杆菌绿脓杆菌绿脓杆菌麻风杆菌麻风杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌寄生虫寄生虫血吸虫血吸虫疟原虫疟原虫弓形虫弓形虫旋毛虫旋毛虫丝虫丝虫毛滴虫毛滴虫绦虫绦虫利什曼原虫利什曼原虫可溶性可溶性抗原抗原酶酶血浆血浆蛋白蛋白毒素毒素细胞细胞因子因子补体补体激素激素小分子小分子化合物化合物第一章第一章抗体类型和抗体技术发展抗体类型和抗体技术发展 第一代第一代 多克隆抗体多克隆抗体 第二代第二代 单克隆抗体单克隆抗体 第三代第三代 基因工程抗体基因工程抗体 第四代第四代 全人抗体全人抗体？鼠源单抗临床应用的障碍鼠源单抗临床应用的障碍 血清半衰期短，血清半衰期短，20h 抗原抗体结合力、亲和力不够抗原抗体结合力、亲和力不够 募集效应细胞产生副作用募集效应细胞产生副作用 HAMA反应：反应：810天出现，天出现，2030天高峰，天高峰，anti-id封闭与抗原结合位点，抗鼠抗体加速单封闭与抗原结合位点，抗鼠抗体加速单抗清除抗清除 过敏性休克过敏性休克影响单抗与靶细胞或抗原结合影响单抗与靶细胞或抗原结合引起变态反应和器官损害引起变态反应和器官损害HAMA反应示意图反应示意图 第一代第一代 多克隆抗体多克隆抗体 第二代第二代 单克隆抗体单克隆抗体 第三代第三代 基因工程抗体基因工程抗体 第四代第四代 全人抗体全人抗体？小鼠抗体嵌合抗体重构抗体人源抗体鼠 100%33%10%0人 0 67%90%100%第一代第一代 多克隆抗体多克隆抗体 第二代第二代 单克隆抗体单克隆抗体 第三代第三代 基因工程抗体基因工程抗体 第四代第四代 全人抗体全人抗体？小鼠抗体嵌合抗体重构抗体人源抗体鼠 100%33%10%0人 0 67%90%100%人人鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 改型抗体（又称人源化抗体）改型抗体（又称人源化抗体）小分子抗体小分子抗体 双特异抗体双特异抗体 抗体融合蛋白抗体融合蛋白基因工程抗体的类型基因工程抗体的类型1、嵌合抗体、嵌合抗体 将人将人Ig C区区与鼠与鼠Ig V区区相连接，从相连接，从而在同一抗体分子中含有不同属来源的抗而在同一抗体分子中含有不同属来源的抗体。体。构建嵌合抗体的基本原构建嵌合抗体的基本原理，从杂交瘤细胞基因组中理，从杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出功能性可变区分离和鉴别出功能性可变区基因，与人基因，与人Ig恒定区基因相恒定区基因相连接，插入适当的载体中，连接，插入适当的载体中，构建成人构建成人鼠嵌合的重链和鼠嵌合的重链和轻链基因，然后共转染骨髓轻链基因，然后共转染骨髓瘤细胞，使之表达嵌合抗体。瘤细胞，使之表达嵌合抗体。表表1 FDA1 FDA批准上市的单克隆抗体药物批准上市的单克隆抗体药物产品产品研究者研究者适应症适应症目标目标抗原抗原批准批准年份年份抗体抗体类型类型ReoproReoproCentocoCentocor r心血管疾病心血管疾病IIIIIIIIIIII19941994嵌合抗体嵌合抗体RituxanRituxanIDECIDEC非霍奇金氏非霍奇金氏淋巴癌淋巴癌CD20CD2019971997嵌合抗体嵌合抗体RemicadRemicade eCentocoCentocor r类风湿关节类风湿关节炎炎TNF-TNF-19991999嵌合抗体嵌合抗体SimulecSimulect tNovartiNovartis s肾脏移植肾脏移植CD25CD2519981998嵌合抗体嵌合抗体2、改型抗体、改型抗体 应用应用CDR移植技术，即移植技术，即将鼠单抗将鼠单抗V区区中互补决定区中互补决定区（CDR）序列取代人源抗体相序列取代人源抗体相应应CDR序列，重构成既具有鼠序列，重构成既具有鼠源性单抗特异性，又保持人抗源性单抗特异性，又保持人抗体亲和力的体亲和力的CDR移植抗体移植抗体（CDR-grafted Ab），也称为），也称为改型抗体或人源化抗体。改型抗体或人源化抗体。表表1 FDA1 FDA批准上市的单克隆抗体药物批准上市的单克隆抗体药物产品产品研究者研究者适应症适应症目标目标抗原抗原批准批准年份年份抗体抗体类型类型SynagisMedimmune呼吸道感染呼吸道感染F protein1998人源化抗体人源化抗体ZenapaxPDL肾脏移植肾脏移植CD251997人源化抗体人源化抗体HerceptinGenentech乳腺癌乳腺癌HER2/neu1998人源化抗体人源化抗体MylotargCelltech白血病白血病CD332000人源化抗体人源化抗体CampathMillennium淋巴瘤淋巴瘤CD522001人源化抗体人源化抗体XolairGenentech中度至严重的中度至严重的因敏感引起的因敏感引起的哮喘哮喘IgE2003人源化抗体人源化抗体Herceptin Genentech 乳腺癌乳腺癌HER2 2006人源化抗体人源化抗体 3、小分子抗体、小分子抗体 利用细菌表达决定抗体特异性的结构域，利用细菌表达决定抗体特异性的结构域，所获抗体片段大小仅为所获抗体片段大小仅为IgG分子的分子的1/3-1/12，因此称之为小分子抗体。因此称之为小分子抗体。小分子抗体包括：小分子抗体包括：Fab 1/3Fab 1/3 Fv 1/6 Fv 1/6 ScFv 1/6 ScFv 1/6 单域抗体单域抗体 1/121/12 MRU MRU Fab片段片段 Fab片段由重链片段由重链VH加加CH1及完整的轻链及完整的轻链构成，在细菌的启动子控制下，在大肠杆菌构成，在细菌的启动子控制下，在大肠杆菌中表达而合成中表达而合成Fab，大小为完整抗体的，大小为完整抗体的1/3，其结构与木瓜蛋白酶消化完整抗体后所产生其结构与木瓜蛋白酶消化完整抗体后所产生的的Fab片段一致。用片段一致。用DNA重组技术制备的嵌重组技术制备的嵌合合Fab片段，其片段，其V区为鼠源性，而区为鼠源性，而CH1、C为人源性的。为人源性的。FVFV片段片段 FVFV片段由片段由V VH H和和V VL L组成，是抗体的抗原结合组成，是抗体的抗原结合部位，分子量只有完整分子的部位，分子量只有完整分子的1/61/6。采用共价。采用共价结合的结合的FVFV片段，在不改变其分子大小的情况下，片段，在不改变其分子大小的情况下，可避免可避免V VH H或或V VL L的解离。的解离。单域抗体和最小识别单位单域抗体和最小识别单位 单域抗体是指单域抗体是指VH或或VL，其分子大小仅，其分子大小仅为完整抗体的为完整抗体的1/12。由单个。由单个CDR构成的小分构成的小分子抗体称为最小识别单位（子抗体称为最小识别单位（MRU）。）。单链抗体单链抗体 单链抗体分子是由一条单一肽链按单链抗体分子是由一条单一肽链按V VH H-Linker-V-Linker-VL L 或或V VL L-Linker-V-Linker-VH H 的顺序组成。分子大小是完整抗体分子的的顺序组成。分子大小是完整抗体分子的1/61/6，ScFvScFv是抗体与抗原结合的最小单位。是抗体与抗原结合的最小单位。ScFvScFv具有以下特点：具有以下特点：具有与原亲本抗体相同的特异性和亲和具有与原亲本抗体相同的特异性和亲和力，但由于分子很小，免疫原性弱，克服了完整力，但由于分子很小，免疫原性弱，克服了完整抗体不易到达靶细胞、清除慢和易引起超敏反应抗体不易到达靶细胞、清除慢和易引起超敏反应及组织损伤等缺点；及组织损伤等缺点；制备流程较其他基因工程抗体简单，可制备流程较其他基因工程抗体简单，可由大肠杆菌发酵产生；由大肠杆菌发酵产生；无无FcFc段，所以减少了与非靶细胞上段，所以减少了与非靶细胞上FcFc受受体结合，使其更特异性集中于靶细胞部位，有体结合，使其更特异性集中于靶细胞部位，有利于作为载体用于药物的导向治疗；利于作为载体用于药物的导向治疗；易进行分子改造，易进行分子改造，ScFvScFv基因片段还可以基因片段还可以与适当的酶基因或毒素蛋白基因重组，转入适与适当的酶基因或毒素蛋白基因重组，转入适当的表达系统，可产生出酶联抗体或具有与抗当的表达系统，可产生出酶联抗体或具有与抗原结合特异性和细胞毒性的重组免疫毒素。原结合特异性和细胞毒性的重组免疫毒素。4.4.双特异抗体双特异抗体(bispecific antibody,BsAb)(bispecific antibody,BsAb)一个抗体分子中的两个抗原结合部一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原决定簇。位可分别结合两种不同的抗原决定簇。制备：制备：化学偶联技术化学偶联技术 基因工程技术基因工程技术 二次杂交瘤技术二次杂交瘤技术BsAbBsAbBsAb BsAb 双特异性抗体双特异性抗体 抗人肝癌单抗抗人肝癌单抗/抗人抗人 CD3单抗单抗 抗抗Her2/neu单抗单抗/抗人抗人CD16单抗单抗 抗人抗人CD20单抗单抗/抗人抗人CD3单抗单抗 抗人卵巢癌单抗抗人卵巢癌单抗/抗人抗人CD3单抗单抗 抗体融合蛋白抗体融合蛋白 抗人卵巢癌单抗抗人卵巢癌单抗-IL-12血吸虫病抗独特型抗体血吸虫病抗独特型抗体-IL-12表表1 FDA1 FDA批准上市的单克隆抗体药物批准上市的单克隆抗体药物产品产品研究者研究者适应症适应症目标目标抗原抗原批准批准年份年份抗体抗体类型类型EnbrelEnbrelImmunexImmunex类风湿关节类风湿关节炎炎TNF-TNF-19981998抗体融合抗体融合蛋白蛋白AlefaceptAlefaceptBiogenBiogen银屑病银屑病CD2CD220032003抗体融合抗体融合蛋白蛋白 重组免疫毒素重组免疫毒素 全人抗体的研究全人抗体的研究 问题：问题：鼠源成分残留鼠源成分残留 稳定性差稳定性差 染色体丢失染色体丢失 人人-人杂交瘤技术人杂交瘤技术 问题：问题：能稳定分泌抗体的亲本细胞很难获得能稳定分泌抗体的亲本细胞很难获得稳定性差稳定性差染色体易丢失染色体易丢失 人人-人杂交瘤技术人杂交瘤技术 英国剑桥大学英国剑桥大学Karpas A(2001)Karpas A(2001)报报道建立了人道建立了人-人杂交瘤技术，获得人杂交瘤技术，获得Karpas 707HKarpas 707H人骨髓瘤细胞株，可制备人骨髓瘤细胞株，可制备全人抗体。全人抗体。转入人的转入人的Ig基因组基因组免疫动物免疫动物全人抗体全人抗体基因敲除小鼠基因敲除小鼠抗体库技术抗体库技术 抗体库的种类：抗体库的种类：初期的抗体库初期的抗体库 噬菌体抗体库噬菌体抗体库 大容量抗体库大容量抗体库 人淋巴细胞人淋巴细胞 抗原筛选产生特异克隆抗原筛选产生特异克隆 RT-PCR 轻链重链基因轻链重链基因 转印至转印至NC DNA重组重组 组合抗体库组合抗体库 E.coli随机表达随机表达 噬菌体抗体（噬菌体抗体（phage antibody）是将克隆的）是将克隆的人人Ab V区基因与一种丝状噬菌体区基因与一种丝状噬菌体DNA上的基因上的基因-或基因或基因精确连接，转染细菌后在其膜表面精确连接，转染细菌后在其膜表面表达表达Fab段（或单链抗体）段（或单链抗体）-噬菌体外壳蛋白噬菌体外壳蛋白（基因（基因-或基因或基因产物）产物）的融合蛋白。的融合蛋白。这种噬菌体在一定意义上讲相当于这种噬菌体在一定意义上讲相当于一个人一个