实时荧光定量PCR技术与应用.ppt

提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 多重多重PCRPCR与内参照基因与内参照基因 定量方法定量方法 定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 基因分型（基因分型（SNPSNP）检测）检测 熔解曲线分析熔解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：PCRPCR概念概念什么是什么是PCRPCR？Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction(PCR)PCR)聚合酶链反应是在体聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定外选择性的扩增特定DNADNA片段的方法。片段的方法。PCR PCR 循环循环第一步第一步 加热变性、双链打开加热变性、双链打开第二步第二步退火、引物与单链结合退火、引物与单链结合第三步第三步 -引物延伸引物延伸变为两个双链变为两个双链DNADNA常规常规PCRPCR常规常规PCRPCR技术：技术：理论上理论上PCRPCR产物的积累是按照产物的积累是按照2 2n n指数扩增指数扩增PCR后借助电泳对扩增反应的后借助电泳对扩增反应的终产物终产物进行定量及进行定量及定性定性分析分析DNA EngineS1 S2 M常规常规PCRPCR常规常规电泳分析方法的局限性电泳分析方法的局限性 只能对终产物进行分析，无法对起始模板只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量准确定量对终产物分析，受对终产物分析，受PCR过程平台效应的干过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差扰，定量准确度难以提高（相对误差1000%）存在扩增产物的污染问题。）存在扩增产物的污染问题。必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事而且费时费事而且EBEB有毒有毒无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 多重多重PCRPCR与内参照基因与内参照基因 定量方法定量方法 定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 基因分型（基因分型（SNPSNP）检测）检测 熔解曲线分析熔解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：定量定量PCRPCR定量定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一每一个循环扩增产物量的变化个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标准曲线实和标准曲线实现对现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析IQ5 Real-time PCR仪定量定量PCRPCR 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR三个关键词：三个关键词：实时，荧光，定量实时，荧光，定量 如何如何实时实时检测？检测？借助借助荧光荧光物质示踪扩增产物量的变化物质示踪扩增产物量的变化PCRPCR反应混合物反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶多聚酶引物引物模板模板DNA或或缓冲液缓冲液荧光物质荧光物质荧光曲荧光曲线线 随着随着PCRPCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图强度信号，得到一条荧光扩增曲线图定量原定量原理理 如何对起始模板如何对起始模板定量定量？通过通过CtCt值值和和标准曲线标准曲线实现对实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析 引入两个概念：引入两个概念：荧光阈值、荧光阈值、CtCt值值定量原理定量原理荧光阈值荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准标准(即即PCRPCR扩增产物量的标准扩增产物量的标准)阈值线阈值线CtCt值的概念值的概念定量原理定量原理CtCt值的定义是值的定义是PCRPCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物(荧光荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t)值值C(t)值值18.12+/0.04-阈值线阈值线模板起始浓度越高，Ct值越小定量原理定量原理CTCT值与值与模板起始浓度模板起始浓度的关系的关系哪个样品浓度高？哪个样品浓度高？为什么要用为什么要用CtCt值定量值定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR方法利用方法利用CtCt的概念，在指数扩的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该尚未放大，因此该CtCt值具有值具有极好的重复性极好的重复性。CtCt值的重现性值的重现性终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒定；CtCt值则极具重现性值则极具重现性 CtCt值的重现性值的重现性相同模板在同一台相同模板在同一台PCRPCR仪上相同条件下仪上相同条件下重复重复9696次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图阈值选择阈值选择阈值的选择阈值的选择荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上置上缺省设置一般是缺省设置一般是3-153-15个循环的荧光信号的标个循环的荧光信号的标准偏差的准偏差的1010倍。倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑系数等参数来综合考虑 定量原理定量原理 理想的理想的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0*2 2n n 非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0(1+Ex)(1+Ex)n n n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数 X X：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量 X X0 0：初始模板量：初始模板量 ExEx：扩增效率：扩增效率在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:logXlogX0 0=-log(1+Ex)=-log(1+Ex)*Ct+log NCt+log N (3)(3)Ct=-1/log(1+Ex)Ct=-1/log(1+Ex)*logX0+log N/log(1+Ex)logX0+log N/log(1+Ex)(4)(4)LogLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理定量原理l初始模板的初始模板的对数值对数值与与循环数（循环数（CTCT值值)呈线性呈线性关系关系l初始模板量越多初始模板量越多,扩增扩增产物达到某一值（域产物达到某一值（域值）时所需要的循环值）时所需要的循环数越少数越少确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度定量原理定量原理Absolute（绝对定量）（绝对定量）Determines input quantity of a nucleic acid targetRequires a standard curve Relative（相对定量）（相对定量）Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samplesPerformed with or without a standard curveTypically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene14500 copies定量方法定量方法 定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。绝对定量绝对定量荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线.未知未知10410310610510210 首先确定未知样品的首先确定未知样品的 C(t)C(t)值值 借助标准曲线由未知样品的借助标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值反推出其初始量值反推出其初始量 得到未知样品初始量绝对值得到未知样品初始量绝对值unknown104103Unknown contains 3108 copies绝对定量绝对定量Livak Comparative Ct Method(2-DDCt)for Relative Quantification1.Normalize C(t):C(t)=C(t)target-C(t)hskg2.Calculate C(t)Average:C(t)Ave=Average C(t)of replicates 3.Normalize to calibrator:C(t)=C(t)Sample Ave-C(t)Calibrator Ave(For calibrator,C(t)=0)4.Fold difference:F=2-C(t)=Normalized fold difference(For calibrator,2-C(t)=1)Note,this formula can be modified to account for reaction efficiencies(Dr.M.Pfaffl)and multiple reference genes(Dr.J.Vondosomple).相对定量相对定量非标准曲线法非标准曲线法 Quantities interpolated from standard curves are used to measure fold differences in target nucleic acidAt least 2 concurrent standard curves are usedOne for gene(s)of interestAt least one for reference geneStandard curves account for reaction efficiencies 使用标准曲线法进行相对定量分析使用标准曲线法进行相对定量分析相对定量相对定量标准曲线法标准曲线法 与传统与传统PCRPCR的比较的比较 实现了初始模板的绝对定量实现了初始模板的绝对定量 检测灵敏度高检测灵敏度高 可以检测到低拷贝的目的基因可以检测到低拷贝的目的基因 可以区分微小的拷贝数差异可以区分微小的拷贝数差异 可以对初始模板含量差异较大的样品同时定可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量量 省时省力省时省力 检测设计灵活检测设计灵活提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 多重多重PCRPCR与内参照基因与内参照基因 定量方法定量方法 定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 基因分型（基因分型（SNPSNP）检测）检测 熔解曲线分析熔解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介：技术简介：SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan荧光化学荧光化学SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理l SYBR Green 1SYBR Green 1 结合到双链结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位l SYBR Green 1SYBR Green 1 染料只有和双链染料只有和双链DNADNA结合后结合后才发荧光才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATC