第3章细胞工程1植物细胞.ppt

第三章第三章 细胞工程细胞工程-植物细胞工程植物细胞工程 1 1 概述概述 2 2 植物细胞工程植物细胞工程一、植物组织培养一、植物组织培养二、植物细胞培养二、植物细胞培养三、人工种子三、人工种子四、植物细胞融合四、植物细胞融合 19721972年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。19781978年梅尔彻斯年梅尔彻斯(Melchers)(Melchers)等首次获得了番等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种茄和马铃薯的属间体细胞杂种“PotamatoPotamato”。目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新材获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。料。1 1 概述概述 一、细胞工程的概念一、细胞工程的概念 是指在细胞水平上，以细胞生物学理论和技术为基础，结合现代工程技术手段以及其他学科的科学原理和技术，研究、开发和利用细胞的现代生物技术。细胞工程细胞工程 植物组织和细胞培养技术植物组织和细胞培养技术 干细胞技术干细胞技术动物组织和细胞培养技术动物组织和细胞培养技术 细胞融合技术细胞融合技术 细胞核移植技术细胞核移植技术 胚胎移植技术胚胎移植技术细胞工程细胞工程:P54:P54微生物细胞工程、微生物细胞工程、植物细胞工程和植物细胞工程和动物细胞工程动物细胞工程根据研究对象不同，根据研究对象不同，可将细胞工程分为可将细胞工程分为（一）基本概念及研究进展（一）基本概念及研究进展 1.1.定义定义 植物组织培养：植物组织培养：是指将植物机体的某一部分是指将植物机体的某一部分(包括器官、组织等包括器官、组织等)取出，使其在无菌和人为控制外取出，使其在无菌和人为控制外因（养分、光照、温度、湿度等）条件下进行培养，因（养分、光照、温度、湿度等）条件下进行培养，从而使其分化、发育出整体植株的技术。从而使其分化、发育出整体植株的技术。2 2 植物细胞工程植物细胞工程 一、植物组织培养一、植物组织培养2.2.研究进展研究进展植物组织培养的理论依据主要有两点：植物组织培养的理论依据主要有两点：1919世纪世纪3030年代施莱登和施旺提出的年代施莱登和施旺提出的细胞学说细胞学说，即细胞是，即细胞是生物有机体的基本结构单位这一理论，使人们想到并生物有机体的基本结构单位这一理论，使人们想到并试图应用无菌培养方法来培养植物的离体部分试图应用无菌培养方法来培养植物的离体部分,在人工在人工控制条件下来研究其生长、发育和分化的规律。控制条件下来研究其生长、发育和分化的规律。1902年，德国植物学家年，德国植物学家Haberlandt提出了提出了植物细胞植物细胞全能性学说全能性学说。植物的器官和。植物的器官和组织可以不断分割，直至分组织可以不断分割，直至分到单个细胞而不影响细胞增到单个细胞而不影响细胞增殖的观点。并设想离体细胞殖的观点。并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。具有再生完整植株的潜力。19341934年美国的年美国的WhiteWhite，利利用番茄根建立了第一个用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，活跃生长的无性繁殖系，发现发现B B族维生素对培养的族维生素对培养的离体根生长具有重要作离体根生长具有重要作用。用。创立了创立了 1943年年White发表了植物组织培养手册的专著，发表了植物组织培养手册的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。19391939年，年，GautheretGautheret连续培养胡萝卜根形连续培养胡萝卜根形成层首次成功成层首次成功 1948 年，年，Skoog和崔徵通和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组过对烟草茎切段和髓培养组织的研究，织的研究，确定了腺嘌呤确定了腺嘌呤生长素的比例是控制芽和根生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。形成的主要条件之一。F.Skoog 1956年年Miller等发现了激动素。控制等发现了激动素。控制器官分器官分化的激素模式变为激动素生长素的比例关系化的激素模式变为激动素生长素的比例关系。指出其能有力诱导愈伤组织分化指出其能有力诱导愈伤组织分化,促进组培发展。促进组培发展。1958年，英国科学家年，英国科学家Steward 等用进行悬浮培养，成功诱导出胚等用进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，状体并分化为完整的小植株，首次获得植株再生成功首次获得植株再生成功。使细胞使细胞全能性理论得到证实，这是植物组培的第一次突破。全能性理论得到证实，这是植物组培的第一次突破。细胞全能性细胞全能性 已经分化的体细胞具有使后代细胞形成完已经分化的体细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能性。能性。生物体的每一个体细胞都包含有该物种所特有生物体的每一个体细胞都包含有该物种所特有的全套遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全的全套遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。部基因。受精卵的全能性最强。其次是生殖细胞，再受精卵的全能性最强。其次是生殖细胞，再次是体细胞次是体细胞 在离体时，在一定的营养物质、激素、其他外界在离体时，在一定的营养物质、激素、其他外界条件下，可能表现出全能性，发育成完整的植株。条件下，可能表现出全能性，发育成完整的植株。植物组织培养的一般程序：植物组织培养的一般程序：脱分化再分化诱导根、芽顶诱导根、芽顶端分生组织端分生组织通过悬浮液培养分散成单细胞通过悬浮液培养分散成单细胞离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽小植株小植株脱分化脱分化再分化再分化植物组织培养植物组织培养胚状体胚状体小植株小植株再分化再分化单细胞单细胞通过悬浮培养分散成通过悬浮培养分散成包以人工包以人工种皮，形种皮，形成人工种成人工种子子1.1.预备阶预备阶段段2.2.诱导诱导去分化去分化阶阶段段3.3.继继代增殖代增殖阶阶段段4.4.生根成芽生根成芽阶阶段段5.5.移栽成活移栽成活阶阶段段（二）植物组织培养的操作技术（二）植物组织培养的操作技术 P56P56切取切取形成层形成层无菌无菌接种接种诱导愈伤组织诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成培养室培养室移栽移栽诱导去分化阶段诱导去分化阶段再分化再分化预备阶段预备阶段继代增殖阶继代增殖阶段段生根成芽阶段生根成芽阶段移栽成活阶段移栽成活阶段A Microspores isolated from banana anthers.Bar 14 m.B Development of callus from anthers after 5 months on induction medium.Bar 2 mm.C Androgenic embryos formed on calli.Bar 4 mm.D Haploid plantlets regenerated from anthers.Bar 3 cmAssani et al.Plant Cell Rep 2003,21,5115161.1.预备阶预备阶段段（1 1）选择合适的外植体。选择时应考虑的因素：）选择合适的外植体。选择时应考虑的因素：外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜。（2 2）除去病原菌和杂菌。）除去病原菌和杂菌。外植体外植体自来水多次漂洗自来水多次漂洗消毒剂处理消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干无菌滤纸吸干由于物种的不同、外植体的差异，组织培养的培养基也是由于物种的不同、外植体的差异，组织培养的培养基也是多种多样，但它们通常都包括以下多种多样，但它们通常都包括以下三大类组成成分三大类组成成分：含量丰富的基本成分，如蔗糖或葡萄糖高达每升含量丰富的基本成分，如蔗糖或葡萄糖高达每升30g，以及氮、磷、钾、镁等。以及氮、磷、钾、镁等。微量无机物，如铁、锰、微量无机物，如铁、锰、硼酸等。硼酸等。微量有机物，如激动素、吲哚乙酸、肌醇等。微量有机物，如激动素、吲哚乙酸、肌醇等。（3 3）配制适宜的培养基。）配制适宜的培养基。分裂素分裂素生长素生长素问：培养基的成分？问：培养基的成分？碳源碳源,氮源氮源 ,无机盐无机盐,生长因子生长因子,水水,除此，培养基中除此，培养基中还需加入植物激素或其类似物还需加入植物激素或其类似物 培养基培养基 MSMS培养基培养基:其特点是无机盐和离子浓度较高；其特点是无机盐和离子浓度较高；B5B5培养基培养基:其特点是含有较低的铵；其特点是含有较低的铵；WhiteWhite培养基培养基:其特点是无机盐低，适于生根；其特点是无机盐低，适于生根；N6N6培养基培养基:其特点是其特点是KNOKNO3 3和（和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量较高含量较高,适于花药培养；适于花药培养；KMKM8P8P培养基培养基:其特点是有机成分较多，适于其特点是有机成分较多，适于 原生质体培养。原生质体培养。培养基多以命名人的名字命名。培养基多以命名人的名字命名。目前，比较流行的培养基有目前，比较流行的培养基有：1.1.生长素生长素 吲哚乙酸吲哚乙酸(IAA)(IAA)，2,42,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸(2,4-D)(2,4-D)，奈乙，奈乙 酸酸(NAA)(NAA)，吲哚丁酸吲哚丁酸(IBA)(IBA)。生长素的生理作用生长素的生理作用（1）既能促进生长，也能抑制生长；（2）既能促进发芽，也能抑制发芽；（3）既能防止落花落果，也能疏花疏果。浓度较低浓度较低,促进生长促进生长;浓度过高浓度过高,抑制生长甚至杀死植物。抑制生长甚至杀死植物。生长素的生理效应生长素的生理效应：使胞壁酸化，增加可塑性，导致细胞伸长变；促进RNA和蛋白质的合成，保证可持续生长。植植 物物 激激 素素植物对生长素的敏感程度如何呢植物对生长素的敏感程度如何呢?（1）营养器官生殖器官）营养器官生殖器官（2）根芽茎）根芽茎（3）幼嫩细胞衰老细胞）幼嫩细胞衰老细胞（4）双子叶植物单子叶植物）双子叶植物单子叶植物植物生长素错当农药植物生长素错当农药 晚稻疯长比人高晚稻疯长比人高当当培养养基中CTK/IAA的比值值高时时，伤组织伤组织形成芽；2.2.分裂素分裂素 6-6-苄基嘌呤苄基嘌呤(6-BA)(6-BA)，激动素，激动素(kinetin,KTkinetin,KT)，玉米，玉米素，嘌呤衍生物素，嘌呤衍生物,6-,6-呋喃氨基嘌呤，呋喃氨基嘌呤，K N K N。19571957年斯年斯库库格和米勒在格和米勒在进进行烟草的行烟草的组织组织培培养时发现养时发现：吲哚乙酸吲哚乙酸(IAA(IAA)，将拟南芥组织置于含生长素将拟南芥组织置于含生长素IBA和细胞和细胞分裂素的环境中诱导愈伤组织的产生分裂素的环境中诱导愈伤组织的产生 生长素只促进核的分裂生长素只促进核的分裂(因促进了因促进了DNADNA的合的合成成)，而与细胞质的分裂无关。，而与细胞质的分裂无关。而细胞分而细胞分裂素主要是对细胞质的分裂起作用，裂素主要是对细胞质的分裂起作用，所以，细胞分裂素促进所以，细胞分裂素促进细胞分裂的效应只有细胞分裂的效应只有在生长素存在的前提在生长素存在的前提下才能表现出来。下才能表现出来。外植体外植体是植物组织培养中用来进行离体无菌培养是植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。组织培养的第一步就是让这些器官或组织切断等。组织培养的第一步就是让这些器官或组织切断去分化去分化.所谓所谓去分化（也叫脱分化）去分化（也叫脱分化）是指离体的植是指离体的植物组织器官或细胞，在物组织器官或细胞，在外源的生长素类物质的外源的生长