第4章遗传的制作和基因定位下.ppt

4.5 4.5 细菌的遗传分析与基因定位细菌的遗传分析与基因定位4.5.14.5.1细菌的转化和基因定位细菌的转化和基因定位转化转化：指某些细菌能通过其细胞膜指某些细菌能通过其细胞膜摄取摄取周围供体的染色周围供体的染色体片段，将此外源体片段，将此外源DNADNA片段通过片段通过重组重组加入自己染色体组加入自己染色体组的过程。的过程。19281928年，格里费斯年，格里费斯(Griffith F.)(Griffith F.)在肺炎双球菌中发现在肺炎双球菌中发现转化现象。转化现象。19441944年，阿委瑞年，阿委瑞(Avery O.T.)(Avery O.T.)成功地进行了肺炎双球菌成功地进行了肺炎双球菌转化试验；证实遗传物质是转化试验；证实遗传物质是DNADNA；转化是细菌交换基因的；转化是细菌交换基因的方法之一。方法之一。细菌中的大部分的转化工作是用下面细菌中的大部分的转化工作是用下面三种细菌完成三种细菌完成的：的：肺炎双球菌，枯草杆菌和流感嗜血杆菌。肺炎双球菌，枯草杆菌和流感嗜血杆菌。转化主要分为二个步骤进行转化主要分为二个步骤进行:(一一)供体供体DNADNA与受体细胞间的接触与互作与受体细胞间的接触与互作 肺炎双球菌转化：肺炎双球菌转化：DNADNA片断至少有片断至少有800800个碱基对；个碱基对；枯草杆菌的转化：枯草杆菌的转化：DNADNA片断至少有片断至少有1600016000个碱基对。个碱基对。转化的第一步是使转化转化的第一步是使转化DNADNA与受体细菌间的成功地与受体细菌间的成功地相互作用，这包括：相互作用，这包括：转化片段的大小、形态、浓度和转化片段的大小、形态、浓度和受体细胞的生理状态。受体细胞的生理状态。.转化片断的大小：转化片断的大小：.供体供体DNADNA分子存在的数目：分子存在的数目：对特定基因来说，供体对特定基因来说，供体DNADNA分子数目与成功转化有关。分子数目与成功转化有关。链霉素抗性基因转化：链霉素抗性基因转化：在每个细胞含有在每个细胞含有1010个个DNADNA分子之前，分子之前，抗性转化体数目一直与抗性转化体数目一直与DNADNA分子存在数目成正比。分子存在数目成正比。原因：原因：在细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的在细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的DNADNA接受接受座位，座位，故一般细菌摄取的故一般细菌摄取的DNADNA分子数分子数小于小于1010个。个。受体的生理状态：受体的生理状态：受体细胞受体细胞必须在生理上必须在生理上处于感受态处于感受态。这种感受态只能发生在细菌生长周期的这种感受态只能发生在细菌生长周期的某一时间某一时间范围内范围内，在感受态内，活跃合成的蛋白质的细菌细胞，在感受态内，活跃合成的蛋白质的细菌细胞壁多少发生改变而壁多少发生改变而易于接受转化易于接受转化DNADNA。、转化转化DNADNA的摄取和整合过程：的摄取和整合过程：细菌中的转化，包括细菌中的转化，包括供体供体DNADNA的结合与穿入，联会和整合的结合与穿入，联会和整合。当细菌处于当细菌处于感受态感受态时，外源双链时，外源双链DNADNA分子可结合在分子可结合在受体细胞表面的受体细胞表面的接受座位上接受座位上。细菌在摄取外源。细菌在摄取外源DNADNA时，时，由由DNADNA移位酶降解其中一条链，并利用降解这条链产生移位酶降解其中一条链，并利用降解这条链产生的能量，将另一条链拉进细胞中。的能量，将另一条链拉进细胞中。.结合与穿入：结合与穿入：供体单链供体单链DNADNA片段一旦进入细胞，按各个不同的片段一旦进入细胞，按各个不同的位点与其相应的受体位点与其相应的受体DNADNA片段联会。片段联会。.联会：联会：单链的转化单链的转化DNADNA通过与受体通过与受体DNADNA对应位点的对应位点的置换置换从而稳定从而稳定地参入到受体地参入到受体DNADNA中。中。整合整合(重组重组)：(三三)转化和基因重组作图转化和基因重组作图 例如：黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验例如：黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验 DNA DNA 片段进入受体细胞之后，可与受体染色体发片段进入受体细胞之后，可与受体染色体发生重组。生重组。紧密连锁紧密连锁的两个基因有较多的机会包括在同的两个基因有较多的机会包括在同一个一个DNADNA片段中，并同时整合到受体染色体中。片段中，并同时整合到受体染色体中。Trp2 his2 tyr1 三者并发转化的频率最高，故这三者并发转化的频率最高，故这3 3个基因是连锁的，个基因是连锁的，其中其中his2his2和和tyr1tyr1连锁紧密：连锁紧密：单交换时，染色体开环易降解，故不存在单交换类型；单交换时，染色体开环易降解，故不存在单交换类型；只有双交换和偶数的多交换才有效的。只有双交换和偶数的多交换才有效的。4.5.24.5.2细菌的细菌的接合接合和基因定位和基因定位1.1.接合：接合：是指原核生物的遗传物质从是指原核生物的遗传物质从供体供体(donor)(donor)转移转移到到受体受体(receptor)(receptor)内的过程。内的过程。特点：特点：需通过需通过细胞的直接接触细胞的直接接触。B B菌株：菌株：Met+bio+thr-leu-Met+bio+thr-leu-，需加需加苏氨酸苏氨酸和和亮氨酸亮氨酸。不同营养缺陷型的大肠杆菌：不同营养缺陷型的大肠杆菌：A A菌株：菌株：Met-bio-thr+leu+Met-bio-thr+leu+，需加需加甲硫氨酸甲硫氨酸和和生物素生物素。4.5.2.14.5.2.1黎德伯格和塔特姆（黎德伯格和塔特姆（19461946年）：年）：A A菌株和菌株和B B菌株营养缺陷型，不能在基本培养上生长。菌株营养缺陷型，不能在基本培养上生长。A A+B B菌株混合培养菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后离心，涂，在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养布基本培养,长出原养型长出原养型(Met+bio+thr+leu+)(Met+bio+thr+leu+)菌落。菌落。这种原养型细胞如何出现？这种原养型细胞如何出现？转化？转化？细胞间直接接触而发生遗传物质交换和重组细胞间直接接触而发生遗传物质交换和重组?A A、B B菌株分别培养在基本菌株分别培养在基本培养基上培养基上 一边加压和吸引一边加压和吸引使培养液充分混合使培养液充分混合 结果任何一臂的培养基上均未长出结果任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。原养型细菌。直接接触直接接触(接合接合)是是原养型细胞出现的必要原养型细胞出现的必要条件。条件。大分子可通过，细大分子可通过，细菌不能通过菌不能通过Hayes(1952)Hayes(1952)试验证明试验证明：接合过程是一种接合过程是一种单向单向转移，转移，A A菌株遗传物质菌株遗传物质 B B菌株，菌株，从供体从供体“donor”donor”到受体到受体“receptor”receptor”。F F 因子：因子：致育因子致育因子(性因子性因子)，是一种附加体。，是一种附加体。携带携带F F因子的菌株称为供体菌或雄性，用因子的菌株称为供体菌或雄性，用F F表示。表示。未携带未携带F F因子的菌株为受体菌或雌性，用因子的菌株为受体菌或雌性，用F F表示。表示。5.4.2.25.4.2.2细菌遗传物质的转移是单向的细菌遗传物质的转移是单向的F F 因子的组成：因子的组成：染色体外遗传物质，染色体外遗传物质，环状环状DNADNA；40-6040-60个蛋白质基因；个蛋白质基因；2-42-4个个/细胞细胞(雄性内雄性内)。4.5.2.34.5.2.3F F 因子的三种状态：因子的三种状态：以大肠杆菌为例：以大肠杆菌为例：一个自主状态一个自主状态F F因子，即因子，即F F；带有一个整合的带有一个整合的F F因子的细胞叫高频重组细胞，因子的细胞叫高频重组细胞，HfrHfr细胞。细胞。没有没有F因子，即因子，即F；自主状态时自主状态时F F 因子独立进行分裂。因子独立进行分裂。F FF F：先形成接先形成接合管，合管，F F因子的因子的DNADNA边边转移边复制，转移边复制，F F细胞细胞 F F细胞。细胞。F F因子整合到细菌染色体上因子整合到细菌染色体上(F(F HfrHfr细胞细胞)，其繁殖其繁殖与细菌染色体同步进行与细菌染色体同步进行。此时，细菌基因的此时，细菌基因的重组频重组频率增加率增加4 4倍倍以上，因此染色以上，因此染色体上整合有体上整合有F F因子的菌株，因子的菌株，称为称为HfrHfr菌株菌株。、HfrHfr细胞的形成及染色体的转移细胞的形成及染色体的转移：细菌染色体由一小段单细菌染色体由一小段单链的链的F F因子为前导而转移因子为前导而转移到到F F-受体受体 边进入边边进入边合成。一般情况下仅小合成。一般情况下仅小部分细菌染色体能够转部分细菌染色体能够转入，接合中断入，接合中断 受体受体细胞仍为细胞仍为F F，F F因子仍留因子仍留在供体内。在供体内。部分二倍体中发生交换部分二倍体中发生交换:单数交换单数交换：打开环状染色体，产：打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞是生一个线性染色体，这种细胞是不能成活的。不能成活的。偶数交换偶数交换：产生可遗传的重组：产生可遗传的重组体和片段。体和片段。部分二倍体：部分二倍体：当当F F或或HfrHfr的细菌染色体进入的细菌染色体进入F F后，在后，在一个短时期内，一个短时期内，F F细胞内的细胞内的某些位点就会成为二倍体某些位点就会成为二倍体的的DNADNA。4.5.2.5 中断杂交作图中断杂交作图中断杂交：中断杂交：就是将两个菌株就是将两个菌株（例如（例如Hfr a+strsF-a-strr）在培养液中进行通风培养，在培养液中进行通风培养，每隔一定时间取样，把菌液每隔一定时间取样，把菌液放入组织捣碎器里搅拌以中放入组织捣碎器里搅拌以中断杂交，经过稀释接种到鉴断杂交，经过稀释接种到鉴别培养基上，待形成菌落后别培养基上，待形成菌落后鉴定它们的基因型。鉴定它们的基因型。1955年年Wollman和和Jacob首次进行中断杂交实验：首次进行中断杂交实验：供体菌：供体菌：HfrH strs thr+leu+azis tons lac+gal+受体菌：受体菌：F-strr thr leu-azir tonr lac-gal-将大约将大约10倍的倍的F-菌与菌与 Hfr对数期菌混合，轻轻振荡培养对数期菌混合，轻轻振荡培养在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌中剧烈振荡在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌中剧烈振荡,中断杂交中断杂交振荡后的培养物涂布于加了链霉素的基本培养基上振荡后的培养物涂布于加了链霉素的基本培养基上筛选不同于两个亲本的筛选不同于两个亲本的thr+leu+strr重组子重组子再对每一个重组子的非选择性标记再对每一个重组子的非选择性标记azi ton lac gal 进行测定。进行测定。azi：叠氮化钠抗性，：叠氮化钠抗性，ton：噬菌体：噬菌体T1抗性抗性n中断杂交实验过程中断杂交实验过程n中断杂交实验结果中断杂交实验结果n（1）不同的非选择标记进入受体且重组的时间不同，但都是稳定的；n（2）各基因的重组频率随着时间的增加而增加，直至极值；n（3）按时间顺序，先重组和后重组的基因，重组率的极值在逐步减少；该方法主要根据基因转移的先后次序，以时间为单位，求基因间的遗传距离。n利用中断杂交实验作图利用中断杂交实验作图 大肠杆菌染色体是环形的大肠杆菌染色体是环形的u不同不同Hfr菌株进行中断杂交实验，菌株进行中断杂交实验，基因转移的顺序、起点和转移方向基因转移的顺序、起点和转移方向各不相同。各不相同。u推断大肠杆菌的染色体为环形，推断大肠杆菌的染色体为环形，而而F因子在细菌染色体上有许多插入因子在细菌染色体上有许多插入位点，且插入方向不同。位点，且插入方向不同。Hfr H o thr azi lac tsx gal trp mal xyl metB thi F C o tsx