疾病基因序列分析.ppt

目的基因的目的基因的PCR扩增扩增及其扩增产物的鉴定及其扩增产物的鉴定分析分析 综合性设计性实验综合性设计性实验此实验共包括如下六个部分此实验共包括如下六个部分1.1.第一部分，目的基因选择第一部分，目的基因选择2.2.第二部分，第二部分，PCRPCR引物设计引物设计3.3.第三部分，第三部分，PCRPCR实验操作实验操作4.4.第四部分，第四部分，PCRPCR产物电泳鉴定产物电泳鉴定5.5.第五部分，第五部分，PCRPCR产物测序鉴定产物测序鉴定6.6.第六部分，目的基因序列变异分析第六部分，目的基因序列变异分析 第一部分第一部分 目的基因选择目的基因选择候选基因简介候选基因简介 在本实验中，有三个候选基因，分别是在本实验中，有三个候选基因，分别是NGALNGAL，FascinFascin和和EzrinEzrin。这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿瘤的发生发展中起重要的生物学作用。瘤的发生发展中起重要的生物学作用。汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行了深入研究，在国外杂志上发表这三个基因进行了深入研究，在国外杂志上发表SCISCI收录研究论收录研究论文文2020余篇，已形成系列优势。余篇，已形成系列优势。同学们可查阅相关资料，选择感兴趣的基因来做同学们可查阅相关资料，选择感兴趣的基因来做PCRPCR实验。实验。NGALNGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalinneutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒细胞明胶酶）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin)lipocalin)家族的一个成员。家族的一个成员。NGALNGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9-9的活性，作为的活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，外，NGALNGAL作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。NGAL NGAL 基因基因NGALNGAL的的mRNAmRNA信息在信息在NCBINCBI核酸数据库中有来自不同核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有BC033089BC033089和和NM_005564NM_005564等，编码区长为等，编码区长为597 bp597 bp，编码，编码198198个氨基酸，个氨基酸，包含了包含了N N端前部长为端前部长为2020个氨基酸的信号肽序列（为核酸个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的序列的1-60 bp1-60 bp）信号肽预测网站信号肽预测网站http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/信号肽信号肽 (signal peptide):(signal peptide):某种分泌蛋白质及细胞膜蛋白质等，以前体物质多肽的某种分泌蛋白质及细胞膜蛋白质等，以前体物质多肽的形式合成，其形式合成，其N N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这种氨基酸序列末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这种氨基酸序列称信号肽或信号序列（称信号肽或信号序列（signal sequencesignal sequence）。）。NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列核酸编码区序列及其相应的蛋白序列：前前2020个个AAAA为信为信号肽序列号肽序列20012001年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系系SHEE SHEE 和食管癌细胞系和食管癌细胞系SHEEC SHEEC 互为对照，用互为对照，用cDNA cDNA 微列阵进行筛选，用微列阵进行筛选，用RNA RNA 印迹和印迹和RT-RT-PCR PCR 进行鉴定，进行鉴定，cDNA cDNA 克隆测序后与克隆测序后与GenBank GenBank 进行进行BLAST BLAST 分析比较。结果表明分析比较。结果表明NGAL NGAL 基因基因在在SHEECSHEEC中出现显著差异过表达，其中出现显著差异过表达，其cDNA cDNA 序列与小鼠序列与小鼠24p324p3、大鼠、大鼠NRL(neu-related lipocalin)NRL(neu-related lipocalin)和人中性粒细胞和人中性粒细胞NGAL NGAL 具有较高的相似性。这提示具有较高的相似性。这提示NGAL NGAL 基因在永生化食管上皮细胞恶性基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。转化中可能发挥着重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。AB利用利用cDNA cDNA 芯片筛选两种细胞的差异表达基因芯片筛选两种细胞的差异表达基因A.A.永生化食管上皮细胞系永生化食管上皮细胞系SHEE SHEE B.B.食管癌细胞系食管癌细胞系SHEEC SHEEC A B C反转录反转录PCRPCR检测检测NGALNGAL在两种细胞的在两种细胞的mRNAmRNA水平水平A.A.永生化食管上皮细胞系永生化食管上皮细胞系SHEE SHEE B.B.食管癌细胞系食管癌细胞系SHEECSHEECC.100 bp DNA markerC.100 bp DNA marker FascinFascin蛋白的蛋白的mRNAmRNA全长为全长为2767bp2767bp，由，由55端非翻译区端非翻译区111bp111bp碱基，碱基，33端端非翻译区非翻译区1174bp1174bp碱基，碱基，1482bp1482bp的全编码序列区和的全编码序列区和6 6个个PloyAPloyA信号肽组成，信号肽组成，编码编码493493个氨基酸，分子量约为个氨基酸，分子量约为55kD55kD。FascinFascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)(ruffles)，边缘的丝状伪，边缘的丝状伪足足(filopodia)(filopodia)、微棘、微棘(microspikes)(microspikes)的核心肌动蛋白束中。的核心肌动蛋白束中。Fascin Fascin 基因基因以往研究发现，以往研究发现，FascinFascin基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌如宫颈癌HelaHela、胃癌、胃癌AGSAGS、大肠癌、大肠癌LM1215LM1215和和SW480SW480、胰腺、胰腺癌癌BxPC3BxPC3和和T3H4T3H4等细胞系中均上调表达。等细胞系中均上调表达。细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密切关系，提示切关系，提示FascinFascin蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。细胞间信息交流等过程中发挥作用。ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAGMTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDG