第11章DNA文库的构建和目标基因的筛选.ppt

第十一章第十一章 DNA文库的构建和文库的构建和目标基因的筛选目标基因的筛选第一节第一节 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建第二节第二节 cDNAcDNA基因文库的构建基因文库的构建第三节第三节 基因克隆的筛选策略基因克隆的筛选策略第四节第四节 DNADNA文库的保存文库的保存 基因库基因库(gene pool)：特定生物体全基因组的集合特定生物体全基因组的集合(天然存在天然存在)基因文库基因文库(gene library)：从特定生物个体中分离的全部基因，从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在这些基因以克隆的形式存在(人工构建人工构建)。根据构建方法的不。根据构建方法的不同，基因文库分为：同，基因文库分为：基因组文库：材料来自染色体基因组文库：材料来自染色体DNA，含有全部基因组序列。，含有全部基因组序列。任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基因组因组DNADNA是衡定的，所以用该生物的任何材料均可构建基因是衡定的，所以用该生物的任何材料均可构建基因组组DNADNA文库且具有一致性。文库且具有一致性。cDNA文库：材料来自文库：材料来自mRNAmRNA，含有全部蛋白编码基因的，含有全部蛋白编码基因的cDNAcDNA，无，无启动子、终止子、内含子、基因间隔区等，序列信息量远小启动子、终止子、内含子、基因间隔区等，序列信息量远小于基因组文库。于基因组文库。在高度分化的生物体中，不同器官、组织、细胞、不同发育时在高度分化的生物体中，不同器官、组织、细胞、不同发育时期以及对不同环境的应答中，期以及对不同环境的应答中，mRNAmRNA种类和丰度不同，即表达种类和丰度不同，即表达谱不同，因此同种生物体的谱不同，因此同种生物体的cDNAcDNA文库随表达谱变化而变化，文库随表达谱变化而变化，用什么材料构建什么样的用什么材料构建什么样的cDNAcDNA文库依研究目标而定。文库依研究目标而定。3第一节第一节 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建一、基因组一、基因组DNA文库的类型和发展文库的类型和发展1、质粒文库：、质粒文库：容纳片段小于容纳片段小于15kb，以菌落的形式保存和筛选，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。2、噬菌体文库：、噬菌体文库：一般用一般用载体，载体，插入型容纳片段小于插入型容纳片段小于7kb，适，适合于构建合于构建cDNA文库，置换型容纳文库，置换型容纳9-25kb，适合于构建亚克，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。隆文库或直接构建基因组文库。3、粘粒文库：、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比比文库略长，达文库略长，达45kb左右。左右。4、人工染色体文库：、人工染色体文库：有有细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)、酵母人工染色体、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)、P1人工染色体人工染色体(P1 artificial chromosome,PAC)等文库，最大插入片段分别为等文库，最大插入片段分别为300kb、1000kb和和300kb，是大片段文库，主要用于基因组测序和，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱构建。图谱构建。45、亚基因组文库：、亚基因组文库：文库的对象只是基因组的一部分，可用染文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、色体显微切割、PFGC特定片段回收、特定特定片段回收、特定YAC富集等方法富集等方法而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。6、基因组文库的发展：略、基因组文库的发展：略二、文库的代表性和随机性二、文库的代表性和随机性代表性代表性意味着文库要有意味着文库要有完备性，完备性，是指在构建的基因文库中任一是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关之间的关系可用下式表示：系可用下式表示：N=ln(1 P)/ln(1 f)。其中：其中：P P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f f=克隆克隆片段的平均大小片段的平均大小 /生物基因组的大小生物基因组的大小。例：人的单倍体例：人的单倍体DNA总长为总长为3.2 x 109 bp，假如文库中克，假如文库中克隆片段的平均大小为隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为，则构建一个完备性为0.9的的基因基因文库至少需要文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基时，基因文库至少需要因文库至少需要180万个克隆万个克隆。随机性随机性既表示构建文库时要从基因组既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。基因文库的质量标准基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件下列条件：1 1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；2 2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 3 3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查；隆排序和染色全步查；4 4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。1、基因组、基因组DNA的制备的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因用于基因组组文库构建的文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。裂。制备的制备的DNA分子量越大分子量越大，经切割处理后样品中含有不，经切割处理后样品中含有不规则末端的规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和片段的比率就越低，重组率和完备性也就完备性也就越高越高。用。用常规方法常规方法制备的染色体制备的染色体DNA的长度一般在的长度一般在100 kb左右左右。AAAA如果先将细胞固定在如果先将细胞固定在低融点凝低融点凝胶胶中，然后置入含有中，然后置入含有SDS、蛋白酶蛋白酶K、RNase的缓冲液的缓冲液中浸泡，可获得中浸泡，可获得1000 kb大大小的小的DNA片段片段三、基因组三、基因组DNA文库的构建流程文库的构建流程 超声波处理超声波处理后的后的DNA片段呈片段呈平头末端平头末端，需加装人工接头，需加装人工接头 部分酶切法部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：，如：Sau3AI或或MboI等，这样等，这样DNA酶解片段的大小可控。酶解片段的大小可控。2、基因组、基因组DNA的切割的切割 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNA片段的切割一般采用片段的切割一般采用超超声波处理声波处理和和限制性内切酶限制性内切酶部分酶切部分酶切两种方法，其目的是：两种方法，其目的是：第一，保证第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；片段之间存在部分重叠区；第二，保证第二，保证DNA片段大小均一。片段大小均一。连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以提高文库质量。进行分级分离，以提高文库质量。3、载体和受体的选择与制备、载体和受体的选择与制备出于压缩重组克隆的数量，用于出于压缩重组克隆的数量，用于基因组基因组文库文库构建的构建的载体通常选载体通常选装载量较大的装载量较大的l l-DNA或柯斯质粒；对于大型基因组或柯斯质粒；对于大型基因组(如动植物如动植物和和人类人类)需使用需使用YAC或或BAC载体。载体。由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNA小于小于10 kb，因此用于，因此用于cDNA文文库库构构建的载体通常选质粒或插入型建的载体通常选质粒或插入型l l载体载体。几种载体的最大装载量：几种载体的最大装载量：质粒质粒 15 kb，-DNA 25 kb，考斯，考斯质粒质粒 45 kb，BAC 300 kb，YAC 1000 kb。用于基因用于基因文库构文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌，建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌，根据载体不同，需要对受体制备感受态或进行合适的培养。根据载体不同，需要对受体制备感受态或进行合适的培养。载体制备中的注意事项：载体制备中的注意事项：1）载体本身要完整）载体本身要完整2）载体去磷酸化要彻底）载体去磷酸化要彻底3）载体纯度要高）载体纯度要高94、连接重组、包装、转化、连接重组、包装、转化/染染连接连接：将制备好的基因组：将制备好的基因组DNA片段与载体片段与载体DNA混合，在混合，在T4 DNA连接酶酶的作用下进行连接，形成重组载体。连接酶酶的作用下进行连接，形成重组载体。基因基因DNA和载体和载体DNA片段要足够纯，杂质少；片段要足够纯，杂质少；连接时基因连接时基因DNA片段与载体片段的摩尔比很重要，根据情况片段与载体片段的摩尔比很重要，根据情况采用载体驱动或基因驱动策略；采用载体驱动或基因驱动策略；连接酶容易失活，操作条件很重要，连接酶容易失活，操作条件很重要，16连接一至数小时。连接一至数小时。质粒载体等的连接产物可以直接转化宿主。质粒载体等的连接产物可以直接转化宿主。包装：包装：基因片段如果与基因片段如果与载体重组，则重组载体重组，则重组需要包装进入特需要包装进入特别制作的外壳蛋白中别制作的外壳蛋白中(包装蛋白要妥善保存包装蛋白要妥善保存)，然后用于感染，然后用于感染大肠杆菌，产生噬菌斑。大肠杆菌，产生噬菌斑。105、文库的质量检测、文库的质量检测克隆子数目要足够多，覆盖度要足够高克隆子数目要足够多，覆盖度要足够高(4-6倍或更高倍或更高)；文库的文库的滴度检测滴度检测：1微克包装微克包装感染大肠杆菌后产生的噬菌斑感染大肠杆菌后产生的噬菌斑的数量的数量(pfu/g)，100万以上万以上才合格。才合格。平均插入片段长度平均插入片段长度：小片段文库采用酶切法或：小片段文库采用酶切法或PCR法结合电法结合电泳进行检测，大片段文库采用泳进行检测，大片段文库采用PFGE电泳进行检测。电泳进行检测。重组率重组率：有目标片段插入的克隆子数占总克隆子数的百分比，：有目标片段插入的克隆子数占总克隆子数的百分比，许多文库的载体系统可以采用蓝白斑鉴定重组率。许多文库的载体系统可以采用蓝白斑鉴定重组率。覆盖度覆盖度：覆盖倍数：覆盖倍数=平均插入片段长度平均插入片段长度 克隆数克隆数/基因组基因组DNA的长度。的长度。或：覆盖倍数或：覆盖倍数=所有探针筛选到的阳性克隆子数所有探针筛选到的阳性克隆子数/总探针数。总探针数。叶绿体叶绿体DNA的比例：小于的比例：小于5%。第二节第二节 cDNAcDNA基因文库的构建基因文库的构建一、一、cDNAcDNA文库的特征和发展文库的特征和发展：cDNA(complementary DNA):cDNA(complementary DNA):以以mRNAmRNA为模板，在反转录酶的作用为模板，在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的下合成的与之反向互补的DNADNA链链(单链单链cDNAcDNA，反义链，反义链)，以单链，以单链cDNAcDNA为模板还可