第11章基因工程与体外表达.ppt

第十一章第十一章基因工程与基因体外表达基因工程与基因体外表达重组重组DNA技术定义技术定义重组重组DNA技术是按照人们的意愿，在体外对技术是按照人们的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增、繁殖以获得在细胞中扩增、繁殖以获得DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。所谓克隆是指通过无性繁殖过程所产生的与亲所谓克隆是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。由于重组代完全相同的子代群体。由于重组DNA技术实验技术实验是对基因操作，故又称为基因克隆或是对基因操作，故又称为基因克隆或DNA克隆，克隆，同时由于这类克隆在分子水平上操作，又称为分子同时由于这类克隆在分子水平上操作，又称为分子克隆。克隆。重组重组DNA技术的重大意义技术的重大意义n重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；n重组DNA技术缩短了进化时间；n重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 克隆基因的表达及检测纯化克隆基因的表达及检测纯化限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 是一类能识别和切割是一类能识别和切割DNADNA分子中特定碱基顺分子中特定碱基顺序的核酸水解酶序的核酸水解酶命名命名:以限制性内切酶来源的微生物学名进行命以限制性内切酶来源的微生物学名进行命名。通常第一字母（大、斜）代表该酶的微生名。通常第一字母（大、斜）代表该酶的微生物物属名属名；第二三字母（小、斜）代表微生物的；第二三字母（小、斜）代表微生物的种名种名；第四个字母代表寄主菌的；第四个字母代表寄主菌的株或型株或型；类类：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两 种功能，但识别、切割位点不一致；类类：有核酸内切酶和甲基化酶功能，但在DNA链上特异切割点在识别位点以外；类类：能识别切割双链DNA特异序列，产生特异的DNA片段；限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类1、产生平末端、产生平末端：在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。类内切酶切割形成端口类型类内切酶切割形成端口类型HindGTCGACCAGCTG2、产生产生5端突出的粘性末端端突出的粘性末端：在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割。Bam HGGATCCCCTAGG53353、产生3端突出的粘性末端SacGAGCTCCTCGAG5335同功异源酶同功异源酶 来源不同的限制酶，识别顺序相同，切割位点可以相来源不同的限制酶，识别顺序相同，切割位点可以相同也可以不同，这些酶称同也可以不同，这些酶称同功异源酶同功异源酶。少数有特殊性质的少数有特殊性质的型酶型酶GGATCCCCTAGGGGTACCCCATGG Bam HGGATCCCCTAGGGGTACCCCATGGBstKpn Asp718 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称后，产生相同的粘性末端，称为为同尾酶同尾酶。同尾酶同尾酶 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 这种酶识别位点与切割位点不一致，但其切割与识别位点距离是一定的，一般为10个碱基。远距离裂解酶远距离裂解酶可变酶可变酶 它们的识别序列中1个或几个核苷酸是可变的。一般识别序列大于6个碱基类限制性内切酶操作注意事项类限制性内切酶操作注意事项1、防止污染，限制酶的量不应超过总量的10%。2、整个操作过程在0进行，一般总是加完其他试剂后，最后加酶。3、酶应分装成小份存储。4、当DNA需要两种以上的酶切时，最好是使用同种缓冲液。(二二)重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基基因克隆需要特定基因克隆需要特定DNADNA载体载体 载体是携带靶载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞，进行扩增和表达片段进入宿主细胞，进行扩增和表达的工具。其本质是的工具。其本质是DNA。用于克隆和扩增特定的。用于克隆和扩增特定的DNA片段的片段的载体称克隆载体，用于表达外源基因的称为表达载体。载体称克隆载体，用于表达外源基因的称为表达载体。载体应具备以下特征：载体应具备以下特征：1.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。制。2.至少应有一个克隆位点，以供外源至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。插入。3.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子分子是否进入宿主细胞是否进入宿主细胞1.1.质粒质粒(plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。质粒是存在于细胞质粒是存在于细胞染色体外的小型双链染色体外的小型双链DNA分子分子,2-200Kb之之间间.本身含有复制功能本身含有复制功能的遗传结构的遗传结构,能在宿主能在宿主细胞独立自主进行复制细胞独立自主进行复制,并在细胞分裂时并在细胞分裂时,保持保持恒定地传给子代细胞恒定地传给子代细胞.缺点缺点:该载体一般只能接受小于该载体一般只能接受小于15kb的外源的外源DNA片段片段.插入插入 过大过大,会导致重组体扩增减慢会导致重组体扩增减慢,甚至插入片段先进丢失甚至插入片段先进丢失.质粒载体质粒载体-pBR322 4.3kb多拷贝松弛型，内含一个（Ori)、一个抗氨苄青霉素（Ampr）和一个抗四环素（Tetr）标记基因，在Ampr 中有两个内切酶位点（PstI、PvuI)，在Tetr 中有三个内切酶位点（EcoRV、BamHI、SalI)。目目 录录PUC系列质粒是由系列质粒是由pBR322质粒中的氨苄青抗性基因、质粒中的氨苄青抗性基因、复制起始点与大肠杆菌复制起始点与大肠杆菌lacZ基因片段改建而成的基因片段改建而成的.1）抗性标记基因抗性标记基因 a.抗生素抗性基因抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Kanr，b.重金属抗性基因重金属抗性基因:Cur，Znr，Cd r c.代谢抗性基因代谢抗性基因:抗除草剂基因抗除草剂基因2）营养标记基因营养标记基因 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。等。标记基因的种类标记基因的种类3）生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZlacZ。半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs，基因产物不具，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：两部分：链和链和链。前者负责四聚体装配，后者具链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为现出酶活性，该作用称之为-互补作用互补作用。这两个部分。这两个部分可独立存在，可独立存在，分别由两个基因编码。为分别由两个基因编码。为链编码的基链编码的基因称之为因称之为lacZlacZ(编码编码145 AAs)145 AAs)。这两个基因（。这两个基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作为标记基因。）均可作为标记基因。P LacZ LacZ 转录转录 翻译翻译 LacZ基因的结构与产物基因的结构与产物pUC18 BamHI片段片段重组重组DNADNA分子分子 转化转化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap的平板上的平板上,白色菌落为重组白色菌落为重组子，子，兰色菌落兰色菌落为为原载体原载体利用利用LacZ基因筛选重组子基因筛选重组子重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切筛选重组子的示意图筛选重组子的示意图AprAprApr转化筛选重组子 白色菌落2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA重组DNA提取DNA 电泳AprAprApr1)限制酶切利用菌落颜色筛选重组子利用菌落颜色筛选重组子 噬菌体是一类细菌病毒噬菌体是一类细菌病毒,有双链噬菌体和单链噬菌体两大类有双链噬菌体和单链噬菌体两大类.前者为前者为噬菌体类噬菌体类,后者包括后者包括M13噬菌体和噬菌体和f1噬菌体噬菌体.噬菌体由于能够携带外源噬菌体由于能够携带外源DNA较大较大,而且感染能力也大于质粒而且感染能力也大于质粒转化细菌的能力转化细菌的能力,所以所以噬菌体一直被作为基因组文库和噬菌体一直被作为基因组文库和cDNA文库文库的克隆载体的克隆载体.M13噬菌体曾被广泛用于制备单链噬菌体曾被广泛用于制备单链DNA以进行以进行DNA序列分析序列分析和体外定点突变和体外定点突变.自从自从DNA测序列仪和测序列仪和PCR技术出现技术出现,代替代替M13噬菌噬菌体在测序和定点突变中应用体在测序和定点突变中应用.目前用于克隆和测序用的目前用于克隆和测序用的PUC载体就载体就是利用质粒和是利用质粒和M13噬菌体改造成的噬菌体改造成的.2.噬菌体噬菌体(phage)载体载体噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。噬菌体基因组为长度可进入溶源状态，也可进入裂解循环。噬菌体基因组为长度为为 48.5kb 48.5kb 的双链的双链 DNA DNA 分子，在噬菌体颗粒内，基因组分子，在噬菌体颗粒内，基因组 DNA DNA 呈线性，其两端的呈线性，其两端的 5 5 末端带有末端带有 1212个碱基的互补单链（粘性个碱基的互补单链（粘性末端），末端），12 12 个碱基的序列为个碱基的序列为 5-GGGCGGCGACCT-35-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌。当噬菌体体 DNA DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状环状 DNA DNA 分子，噬菌