过表达ABAD对Aβ1-42刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响.docx

过表达ABAD对AB2刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响洪婷婷张宇崔理立"()广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524001【摘要】目的探讨Api/刺激下，在293T细胞中过表达ABAD对线粒体功能的影响及自噬相关标记蛋白水平的变化。方法293T细胞分别经APM2(5M10M20M)处理后，ATP试剂盒测定其细胞ATP含量；活性氧试剂盒测定其活性氧生成量。自噬诱导剂处理后，WeSternbIot观察线粒体自噬相关蛋白表达量的改变。通过标准曲线换算ATP细胞含量和活性氧生成量，用ImageJ对WeSternbIOt条带进行量化。结果对照组与293T过表达ABAD组ATP含量和活性氯生成量无明显差异(P均>0.05)；与不给药组相比,在给予Aj2(IOuM)刺激后，293T细胞过表达ABAD的ATP含量减少，差异具有统计学意义(P<0.05),但两组的活性氧生成量无明显差异(P>0.05)；与DMSO处理对照组相比，CCCP自噬诱导剂处理组在Apb42IOuM诱导后线粒体自噬相关蛋白P62降低、LC3B升高，差异均有统计学意义(PvO.O5)o结论过表达ABAD不影响293T细胞的线粒体功能，但在特定浓度A,42刺激下可影响线粒体ATP产生及促进线粒体自噬发生。【关键词】：ABAD,A,线粒体功能：线粒体自噬；【中图分类号】R74【文献标识码】AEffectsofoverexpressionofABADonmitochondrialfunctionandautophagyof293TcellsstimulatedbyA,42HONGTing-tingZHANGYuCUILI-li*Guangdongprovincialkeylaboratoryofagerelatedheartandbraindiseases,GuangdongMedicalUniversity'Zhanjiang524001,Guangdong,ChinaAbstractobjectivetoinvestigatetheeffectofoverexpressionofABADonmitochondrialfunctionandthelevelofautophagy-associatedmarkerproteinin293TcellsstimulatedbyA32Methods293TcellsweretreatedwithAp42(5uM,IOuM,20uM)respectively,andtheirATPcontentwasmeasuredbyATPkit,andtheproductionofreactiveoxygenspecies(Ros)wasmeasuredbyRosKit.Aftertreatedwithautophagyinducer,theexpressionofMitochondrialautophagy-relatedproteinswasobservedbyWesternblot.TheamountofATPcellsandreactiveOxygenSpecies(Ros)werecalculatedbystandardcurve,andtheWesternblotwasquantifiedbyImageJ.ResultstherewasnosignificantdifferenceinArPcontentandreactiveoxygenspeciesproductionbetweenthecontrolgroupand293Toverexpressionabacigroup(P>0.05);comparedwiththecontrolgroup,theATPcontentof293TcellsoverexpressionABADwasdecreasedafterAm2(IOuM)stimulation,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05),buttherewasnosignificantdifferenceintheproductionofreactiveoxygenspeciesbetweenthetwogroups(P>0.05);comparedwiththecontrolgrouptreatedwithDMSO,mitochondrialautophagyrelatedproteinP62decreasedandLC3BincreasedinthegrouptreatedwithCCCPautophagyinducerafterAB.42(IOuM)stimulation(P<0.05).ConclusionoverexpressionofABADdoesnotaffectthemitochondrialfunctionof293Tcells,butcanaffecttheproductionofmitochondrialATPandpromotethedevelopmentofmitophagyunderthestimulationofA陋KeywordsAbad,A,mitochondrialfunction;MitochondrialAutophagyABAD(淀粉样蛋白结合醇脱氢酶)，也称170-HSDl0,是一种线粒体蛋白质。已知ABAD有一个LD区域，可特异性与A0结合，A。与ABAD形成的复合物导致ABAD结构异常，进而阻止ABAD与NAD+的结合，ABAD不能发挥酶活性，线粒体膜通透性发生变化，进而导致线粒体窘迫和细胞毒性。此外，ABAD可调节线粒体基质中的亲环蛋白D(cypD),后者可调节线粒体通透性过渡孔的开放。同时，已知人线粒体RNaSeP是由三种蛋白质(MRPPl(线粒体核糖核酸酶P蛋白1),MRPP2(17P-HSDlO)和MRPP3(Mg2+依赖性核糖核酸内切酶)组成，ABAD是MRPPl蛋白稳定表达所必需的，ABAD的突变会引起RNaseP组分活性降低和RNA加工缺陷，导致线粒体功能紊乱W叫A。肽是由a、和y-分泌酶水解酶切淀粉样蛋白前体蛋白(APP)所产生的。正常情况下，绝大部分产生的是A40,少量是A42,但后者具有更强的疏水性、聚集性以及神经毒性。A仇K可随年龄依赖性快速生成并积聚，引起神经毒性。研究发现A可聚集在线粒体内，降低呼吸链复合物酶的活性，减少线粒体的耗氧量，增加活性氧的产生，最终导致线粒体肿胀及后续的细胞凋亡比叫线粒体作为机体细胞代谢的能量工厂，通过不断的分裂和融合以为适应生命活动的需要，受损或多余线粒体的清除是维护细胞内环境的关键，线粒体自噬作为选择性自噬的一种类型，是机体清除受损线粒体的重要形式之一。理论上，线粒体功能絮乱，包括膜电位下降、活性乳生成增多、ATP产量减少等，会诱导机体启动线粒体自噬，受损线粒体通过与溶酶体结合，清除受损的线粒体。但目前尚未有ABAD与线粒体自噬的相关报告。本篇文章研究了在APy刺激下过表达ABAD对293T细胞线粒体功能的影响，并探究其是否影响自噬相关蛋白的水平。1材料与方法1.1 材料293T细胞（上海中乔新舟生物公司），血清、胰酶、双抗（美国GibCo公司），DMEM/F-12培养基（美国HyClone公司），（美国GibC。公司），LipoFiter>BCA蛋白检测盒（美国ThermO公司），ABAD过表达质粒、ABAD干扰质粒（上海毅乐生物），增强型ATP检测试剂盒、活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术），CCCP（MCE）,A1.42（上海强耀生物科技有限公司），DMSO（青岛生物科技），抗体：LC3B（Sigma）,P62、ABAD（Abcam）,P-actin（CST）,低温高速速离心机（德国Eppendorf公司），酶标仪、化学发光仪（美国Thermo公司），曝光机（美国AzureBiosystems公司）。1.2 方法1.2.1 细胞培养与分组293T细胞购买于上海中乔新舟生物公司，使用完全培养基（10%胎牛血清+1%的双抗+高糖培养基）在37、5%C2细胞培养箱传代培养。倒置显微镜下观察细胞，每隔23d传代1次，用含EDTA胰酶消化3min,加两倍体积培养基终止胰酶消化。传代3次后进行实验。分组为1、正常组、ABAD过表达组、正常给药组（Ap.425uMIOUM、20uM）、ABAD过表达给药组（A425uMIOuMs20uM）1.2.2 细胞转染严格按照汉恒LiPOFiter说明书转染。细胞传代3次后，按IxIO5/孔接种，细胞培养箱中培养24h,在细胞密度在60%左右进行转染。ABAD过表达和ABAD干扰转染终浓度为2ug孔。转染5-6h后，更换新的培养基继续培养。24h后，用配制的不同浓度APy2刺激细胞24h1）1.2.3 A阮42的配制AB2母液配制：取人源A2单体，用HFlP重悬，在通风橱中挥发后获得A。肽膜，以DMSO溶解肽膜，稀释至适当浓度后，37孵育48h后即得到AB寡聚体，孵育后的溶液1周内使用。1.2.4 CCCP的配制CeCP母液配制：离心试管，在无菌操作台中称取适量CCCP粉末，加入DMSO,使浓度为20mM,充分震荡混匀离心，即得到CCCP母液，1月内使用。1.2.5 ATP检测按照产品说明书操作，吸除培养液，10OUl裂解液/12孔板每孔，移液器反复吹打,充分裂解细胞。裂解后4C12000g离心5min,吸取的上清即为样品。按照每个样品/标准品需IoOUlATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的ATP检测试剂，用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂(1:4)。稀释后的ATP检测试剂即为ATP检测工作液。加IoOUlATP检测工作液到检测管内，室温放置5min。检测管内加上20Ul样品/标准品，迅速用枪混匀，间隔2s后，用化学发光仪测定RLU值。1.2.6 ROS检测按照产品说明书操作，用无血清培养液稀释DCFH-DA(GoOO),使终浓度为10微摩尔/升。用稀释好的DCFH-DA重悬细胞，细胞浓度控制在约一百万至二千万/ml,37细胞培养箱中孵育20min。隔5min上下颠倒混匀，待探针和细胞充分接触后，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用流式细胞仪检测荧光的强弱。1.2.7WesternBlot移除培养液，用冰PBS小心洗一遍，按IoOUI裂解液/6孔板每孔的比例加入裂解液，置于摇床冰上，裂解15min,用细胞刮充分刮数下，收集蛋白至EP管。检测细胞浓度(BCA蛋白检测法)。各组样本取相同摩尔质量和体积的蛋白量进行SDS-PAGE电泳(初始电压为60V,待蛋白条带入分离胶，调整电压至IoOV),预先将PDVF膜泡在甲醇液中5-1Omin,待电泳结束，将其转印至PVDF膜，赶走膜和胶之间的气泡，放入转膜槽(100mA,10Omin),IXTBST稀释的5%脱脂牛奶，摇床上常温封闭lh。将一抗和膜置于孵育袋中共同孵育，(一抗稀释液配制所有的一抗，浓度为1:1000),4度摇床过夜。回收一抗，1XTBST洗膜三次，IOmin/次。二抗用IXTBST稀释的5%脱脂牛奶溶解，与膜在摇床上常温孵育lh。IxTBST洗膜三次，1Omin/次。显色及曝光。将归一化后目标蛋白灰度值与内参-actin灰度值之间比值视为目标蛋白相对表达量。1.2.8 统计方法所有实验重复至少3次。用GraPhPadPriSm6.0对实验结果进行统计分析。表中数值均为平均值±标准误差(-÷s)o数据采用单因素方差分析(ANOVA)或者t检验进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果1、在293T细胞过表达