膝痛颗粒方对膝骨关节炎大鼠动物模型关节液中炎症因子的影响.docx

膝痛颗粒方对膝骨关节炎大鼠动物模型关节液中炎症因子的影响黄江海I戴雨润2尉志强I方志远I温鑫柱I韩良I李运海I柏立群I赵东方,*(1北京中医药大学东方医院北京I(X)O78；2北京市丰盛中医骨伤专科医院北京Io(X)32)摘要目的：研究膝痛颗粒方治疗大鼠膝骨关节炎的作用机制。方法：将60只SD大鼠随机分为6组：空白组(K)、模型组(三),硫酸氨基葡萄糖组（八）、膝痛颗粒方组(按不同浓度分的浓度L组、中浓度M组、高浓度H组)。造模成功后，用不同浓度的膝痛颗粒方及硫酸氨基葡萄糖胶囊干预，4周后取膝软组织标本进行HE染色来评估其滑膜增生程度；通过ELISA法检测血清中炎症因子(IL-IB)、基质金属蛋白(MMP-3、MMP-13)>TNF-的表达情况；对大鼠膝关节滑膜及软骨组织采用免疫组化法检测趋化因子SDF-I蛋白及CXCR4受体的表达情况。结果：LHE染色结果：所有大鼠的膝关节软骨均可见退变，其中模型组大鼠的炎性细胞浸润、滑膜增生纤维样变及软骨破坏表现最重，而高浓度膝痛颗粒方组大鼠的退变程度最轻。2.ELISA法检测结果：药物组和模型组的IL-IB、TNF-a、MMP-3、MMP-13指标均较空白组升高(PVO.05),其中比较不同浓度的膝痛颗粒方组之间的炎症因子和基质金属蛋白酶的水平时发现，四项指标具有相同的趋势，即L组>M组>H组，M组与L组，P<0.05,M组与H组比较分析无显著统计学差异(PX).05)。3.免疫组化法检测结果：SDF-I和CXCR4的光密度值结果显示模型组和药物组的明显比空白组高；各治疗组的阳性细胞率较模型组明显升高(P均0.05)。结论：1.膝痛颗粒方能降低Kc)A大鼠关节中IL-IB、TNF-中、MMP-3、MMP-13的含量，减轻关节炎症反应；2.膝痛颗粒方可以抑制趋化因子SDF-I的表达。关键词：膝关节骨性关节炎；膝痛颗粒方；SDF-IEffectofXitonggranuleformulaoninflammatoryfactorsinarticularfluidofratmodelofkneeosteoarthritisHUANGJiang-Iiai1,DAIYu-run2,ZHAODong-fang,",q.al.(1DongfangHospitalofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing,100078,China;2BeijEgFengshenSpecialHospitalofTraditionalMedicalTraurnatologyandOrthopedics,Beijing,100032,China)ABSTRACTObjective:ToexplorethemechanismoftreatingratKOAwithXitongKelifang.Methods:60SDratswererandomlydividedinto6groups:blankgroup,modelgroup,aminoglucosesulfategroup（八）,kneepaingranuleprescriptiongroup(concentrationLgroup,mediumConcenlralionMgroup,highconcentrationgroup).Aftermakingthemodel,Withdifferentdrugs,28dayslater.EvaluationofsynovialhyperplasiainratsbyHEstaining;TheexpressionofIL-I3、TNF-MMP-3、MMP-13proteininserumwasdetectedbyELISAmethod;TheexpressionofchemokineSDF-IproteinandCXCR4receptorinsynoviumandcartilageofkneejointwasdelectedbyimmunohistochemistry.Results:IHEstainingresults:groupsizeInthemodelgroup,cartilagedestruction,synovialhyperfibrosisandinflammatorycellinfiltrationwerethemostsevere,whileinthehighconcentrationgroup,thedegreeofjointdestructionwastheleast.2.TheresultsofELISAzMethodshowedthatthe1L-I>TNF-a、MMP-3、MMP-13indexofeachtreatmentgroupandmodelgroupwashigherthanthatoftheblankgroup(P<0.05),WhencomparingthelevelsofinflammatoryfactorsandmatrixmetalIoproteinofinflammatoryfactorsandmatrixmetalloproteinasesbetweendifferentconcentrationsofKneelonggranuleprescriptiongroup,thatis,Lgroup>Mgroup,MgroupandLgroup,P>Mgroup0.05.TherewasnosignificantdifferencebetweenMgroupandHgroup(P>H0.05).3.Resultsofimmunohistochemicalmethod:theSDF-IandCXCR4opticaldensityofmodelgroupandtreatmentgroupwereobviousThepositivecellrateoftheblankgroupwassignificantlylowerthanthatofthemodelgroup(P<0.05),andthepositivecellrateofeachtreatmentgroupwassignificantlyhigherthanthatofthemodelgroup(P<0.05).Conclusion:1.KneepaingranulecanreducethecontentOfIL-10、TNF-a、MMP-3、MMP-13injointofKOAratsandreducetheinflammatoryreactionofthejoint.2.KneelonggranulecaninhibittheexpressionofchemokineSDF-1.Keywords:Kneeosteoarthritis;Kneepaingranuleprescription;SDF-I前言膝骨关节炎是骨伤科临床治疗的难题之一，主要因于膝骨关节炎发生发展的机制复杂，诱因较多，其病因及发病机制尚未完全明确。膝痛颗粒方是笔者导师柏立群教授治疗膝OA临证多年的经验方，并开展了多项相关课题研究，经过临床十余年的应用验证，该方在膝骨关节炎的治疗上临床效果显著用31-33L通过文献研究发现SDF-I/CXCR4信号通路与OA有明确的相关性WT2、2"，本研究基于前期课题主要研究结果，建立大鼠KOA模型，进一步从分子机理层面探索膝痛颗粒方的对于KOA的治疗机制。1实验方法1.1 实验药物膝痛颗粒方组成：鸡血藤15g,川牛膝15g,白芍15g,丹参15g,甘草9g,伸筋草15g,当归12g,淫羊番15g,桂枝9g,附子6g,川莺6g,木瓜15g,茯苓15g,陈皮9g,砂仁6g,绵革菊20g,泽泻9g,车前子10g,全蝎6g,防风10g。1.2 实验动物60只7周龄雄性SD大鼠。适应性饲养一周，动物伦理学的标准要求下进行实验。1.3 实验动物分组60只大鼠适应性饲养后随机分为6组：K组空白组(n=10)、S组模型组(n=10)>A组硫酸氨基葡萄糖组(n=10),膝痛颗粒方组(n=30),其中按照不同浓度的膝痛颗粒方将其随机分为L组低浓度组(n=10).M组中浓度(n=10)>H组高浓度(n=10)。1.4 动物处理将各组大鼠右膝关节备毛后，严格消毒后，准备关节穿刺。向K组以外的其他各组大鼠的右膝关节注射药物复制大鼠KOA模型：配制浓度为40mgml的碘乙酸钠生理盐水溶液(MIA溶液)适量，弯曲大鼠右膝关节，使关节间隙充分显露后，向关节内注射50ulMIA溶液。向空白组大鼠，右膝关节注射50Ul生理盐水。观察2周。随机选取3只造模大鼠，麻醉后处死，暴露造模膝关节，肉眼直视下观察关节情况，若出现明显滑膜增厚、软骨水肿或软骨缺损甚至可见软骨下骨者，视为造模成功。造模成功当天即开始灌胃干预。按人和动物间体表面积的等效剂量比值折算给药浓度和剂量：大鼠的等效剂量相当于人的0.15倍。空白组不做任何处理；膝痛颗粒方低、中、高组每天分别以10.5g/kg、21gkg>42gkg的膝痛颗粒方水溶液灌胃。模型组每天予以体重相关剂量生理盐水灌胃；硫酸钱基葡萄糖组每天予0.17gkg的硫酸氨基葡萄糖水溶液灌胃。连续灌胃4周。1.5 标本采集血清制备：所有实验动物于末次灌胃1天后，取血清标本。80冰箱保存。关节软骨及滑膜标本采集：切开关节囊后，将增生的滑膜用组织剪小心的取下，置于做好标记的EP管中，迅速置于液氮桶内保存，然后将骸骨、胫骨平台、股骨远端关节面的软骨用手术刀片刮取下来，置于做好标记的EP管中，避免将软骨下骨切下，放入另一液氮桶中冻存。各组随机选5只大鼠，留备后期制备石蜡切片进行HE染色。1.6 实验指标检测HE染色：制备石蜡标本，制作切片，然后进行HE染色，中性树胶封固。ELISA检测：以ELISA实验法检测各组血清标本中炎症因子IL-IB、基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-13)及TNF-的表达水平。免疫组化检测：分别使用大鼠SDF-kCXCR4.II型胶原一-抗及二抗试剂盒对前述所取的大鼠膝关节软骨及滑膜按以下步骤进行制片免疫组化染色。1.7 数据整理与统计分析应用SPSS20.0统计软件分析实验所得数据：计量资料以均数土标准差(x±s)表示，组间的计量结果符合正态分布，分析选用独立样本t检验，不符合正态分布则选择秩和检验;用单因素方差分析对多组间的数据结果比较进行分析，P>0.05,非显著性差异，无统计学意义；P<0.05,显著差异，有统计学意义。对HE染色切片及免疫组化染色的切片应用ImageProPlus软件进行图像分析。2结果2.1大鼠膝关节HE染色结果K组：关节腔完整，滑膜细胞排列规则，软骨面光滑，无炎性细胞浸润。S组：关节腔被滑膜组织中增生的绒毛上皮细胞侵入；可见滑膜组织纤维化及关节面软骨损伤(I11°-1V°)；腔内炎性细胞聚集；A组:滑膜组织增生，细胞排列基本规整，滑膜细胞伴随大量血管增生，软骨面退变(11o)；1.组：可见滑膜增生伴有部分纤维化，细胞排列紊乱，滑膜细胞局部伴随血管增生;软骨面退变(IIo)；M组：关节腔完整，滑膜细胞伴随大量血管增生，软骨面I°退变；H组：关节腔正常，可见少量滑膜细胞增生，排列规则。软骨面光滑。图1各组大鼠膝关节HE染色Fig.1HEstainingofkneejointineachgroup2.2血清中IL-IB、TIN-、MMP3、MMP-13表达水平的比较结果这四个指标结果比较：空白组较其余五组的明显较低，P<0.01;而药物干预组的指标均不同程度的低于模型组，P<0.01;其中：A组与L组的四个指标水均平近似，P>005,M组及H组的四个指标明显低于A组(P<0.01)；在不同浓