防龋DNA疫苗pVAX1-SG免疫下大鼠乳腺FcRn的表达研究.docx

I防弱DNA疫苗pVAXl-SG免疫下大鼠乳腺FcRn的表达研究I邹潇龙I王月月2,吴砧冰3,犹然淞4,周民希"陈彬"（1.遵义医科大学口腔疾病研究特色重点实般室,贵州遵义5630062.遵义医科大学附属口腔医院，贵州遵义5630）I摘要I目的：本研究在SD大鼠不同生理阶段以及免疫条件下分析乳腺FCRn基因mRNA表达量的变化，探索防隔DNA疫苗 PVAXlSG对大鼠乳腺FCRn表达的影响，方法：将40只雌性受孕SD大鼠随机分成四蛆（防般DNAI5苗组，空戟质粒蛆，生理 盐水组，空白对照组），在其分娩后第I天及第1周分别用对应试剂进行注射，第2周处死SD大鼠并取乳腺迸行mRNA检测.结 果：经防踽DNA疫苗pVAXlSG免疫后的大鼠乳腺FCRn基因表达量较正常组大鼠乳腺FCRn基因表达量显著上升（p<0.05）. 结论：防lDNA疫苗PVAXl-SG可以提高大鼠乳腺RRn的表达.I关健词I防舒DNA疫苗；乳腺FCRn；免疫表达；Anthcaries DNA vaccine pVX 1 SG immunized rat mammary FcRn of expression researchZom Xiaolong i. l%"g Yueyue2.Wu MingrUi3, You Lausng4.Zhou Chexi5.Che> Bin I*. （I. Key Laboratory Of Oral Disease Resean h, Zunyi Medical University, Zunyi 563006, China： 2. Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Znnyi 563000, China ）Abstract Objectives Herein, in order to vxpl<>rc the effects of anti-caries DNA vaccine pVAXl-SG on the expression of nits批注IAW请补充：第一作者：姓名（年份），性别， 职称，主要研究方肉通讯作者；姓名（年份），性别，职称，主要研究方 向t E-mail TTt投稿论文的题目、摘要、关健词、图题、表题、图注、 表注以及中文参考文献必须有中英文对照（中文汇献、二； 娈翻译的（本身就有英文翻译的再翻译，本身无英文翻 译的保留中文就可），请先列出英文同译后是中文批注A2:知网13.4%万方37.82%.文章现制率较高请修改至20以下，引用他人文字 部分可换种表达方法，或者正文相应增加些内容，复 制率均可下降,如要自行查受制率请剔除摘要和文献. 只杏正文部分breastFcRn,thechangesofmRNAexpressionobreastFcRngeneinSDratsWereanalyzedatdiferentphysiologicalstagesandunderimmuneconditions.Methods40fcmalc-conceivedSDratxwererandomlydividedintofourgroupswhichwereIabclsanti-VariesDNAvaccine,emptyplasmid,physiologicalsaiincwandblankcontrolgroups.Atthefirstday.thestudiedrateswereimmunizedwithcorrespondingreagents,respectively.Subsequently9afterthedeliver)'forIweek,theSI)ratswereexecutedandthemammaryglandwastakeninthesecondweekfordetection.ResultssTheexpressionofFcRngeneinthemammaryglandsafterimmunizationwiththeanti-cariesDNAvaccinepVAXl-SGassignificantlyhhcrthanthatofthenormalg)pofrats(p<0.05).ConclusionsTheanti-cariesDNAvaccinepVAXl-SGcanincreasetheexpressionofFcRninrats'InHInmaryglands.Keywords)nti-cariesDNAvaccine;BreastFcRnzImmuneexpression;FcRn是一种位于细胞膜表面的IgG抗体受体,其蛋白结构和MHC-I分子类似,主要在内皮细胞中表达，其结构包含由链和。2微球蛋白组成的异二聚体FcRn可以和IgG的Fc部分结合，阻止IgG分子被溶酶体裂解，可以起到增长IgG体内半衰期的作用，参与到IgG的体内转运、维持和分布代谢过程中ULFCRn作为将IgG从母体传递到幼崽体内的特异性载体，WallaCe和ReeS在啮齿类动物刚出生的幼崽小肠上皮细胞刷状缘上首次分离得到。FCRn在许多成年哺乳动物的呼吸道、消化道和生阳道的黏膜上皮细胞及肺脏、肝脏、肾脏、胎盘及乳腺等组织都有表达a”FCRll与IgG在酸性环境中结合，在中性环境解离，其相互作用具有PH值依赖性二因此，IgG从组织间隙液中流经乳腺上皮细胞过程中,在腺泡上皮细胞的基底侧与酸性环境中的FcRn结合,经胞吞转运释放到腺胞腔中。防僦DNA疫苗免疫后产生的抗体在许多哺乳动物比如小鼠的肾脏、肝脏、血管内皮细胞等组织器官都有表达网。FCRn在不同动物中传递母体IgG的途径不同。比如：在人和兔子中主要通过胎盘内转运母体的IgG分子，在乳汁中则几乎不含IgG;在啮齿类动物中一部分可以通过胎盘中的FcRn转运母体IgG分子，部分可以通过乳腺中的FcRn转运IgG.FCRn可以调控血清中IgG的浓度，当IgG少的时候，与IgG结合可以保护其不被体内溶菌满降解，延长IgG的半衰期I'。L益金项目I步州有普通ItJi等学校青年科技人才成长项目（髀科鲁KY字20221276号九贵州省普通四等学校为年科技人才成长项目<黔科合KY字2O22289号L费州省卫生做康委科学技术珞金项目<szwkj202l-351）.i®义法科大学大学生创新创业VH炼计划项U（ZYDCiZYDC）,胃州省科技计划项H（评科合基础2O2O）IY292通倡作者：陈彬TebEmail:DNA疫苗是一种灵活且全面的抗原递呈系统，本课题组前期构建的口腔疾病DNA疫苗对机体可以起到免疫增强和抗原递呈的双重功能，能同时剌激体液免疫及细胞免疫，能显著增强T细胞增殖、分化，诱导多种亚型的特异性抗体产生，引起多种动物对多种抗原产生高滴度的抗体应答。防降DNA疫苗免疫后产生的抗体在许多哺乳动物比如小鼠的肾脏、肝脏、血管内皮细胞等组织器官都有表达UL课题组前期研究发现在口腔防断DNA疫苗免疫条件下大鼠乳汁中IgG含量提高，FCRn作为将IgG从母体传递到幼患体内的特异性载体，IgG的增高是否是由于乳腺内FCRn基因表达变化所致，目前并没有此方面的研究报道。因此，本实验将不同生理状态下的受孕SD大鼠用不同的试剂进行免疫。探索防醯DNA疫苗是否可以提高大鼠乳腺FcRn的表达。I材料与方法主要试剂1.B肉汤培养基（北京索莱宝科技有限公司，中国），培养皿（北京索莱宝科技有限公司，中国），卡那毒素溶液（北京索莱宝科技有限公司，中国），无内锋素质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司，中国），防耦DNA疫苗PVAXI-SG（课题组前期构建）。1.1 方法1.1.1 实验动物及分组健康的雉性SD大歌20只，（体重30Og左右）：健康的雌性SD大鼠60只（体重30Og左右）；每1只公鼠笼中放入3只雌鼠进行交配受孕。第二天检杳阴道栓，有阴道栓的可以计为妊娠1山选择有阴道栓记录时间和腹部明显变大的雌鼠作为怀孕大鼠共40只，随机分为四组：防龊DNA疫苗组，空载质粒组，灭菌生理盐水组，空白对照组：在大鼠分娩的Id和7d分别注射相应试剂：防鹤DNA疫苗，空载质粒、灭菌生理盐水，空白对照组不处理。在第二次免疫后7天采集乳腺后生理盐水冲洗，装入无菌、无酶EP管放入液氮速冻后.80C保存。122主要试剂的配制LB液体培养基的配制：按照每100ml液体加入LB粉末2.5g的比例配置，高压锅灭国，待液体降温到506Ot时，于超净台中按照每20OmL的液体加入卡那寄素溶液60-80L的比例加抗生素，LB固体培养基的配制：按每IOomL液体加入25gLB与Ig琼脂粉的比例配置，配置完成后经高压锅灭菌，待液体降温到50-60C时，于超净台中按照每200mL的液体加入卡那霉素溶液60-80L的比例加抗生素，倒入培养皿中，待其自然凝固。123菌种的豆苏将有重组质粒PVAXl-SG的大肠杆菌菌种解冻、豆苏、培养：取出-80'C条件下保存的大肠杆菌，置于超净台内用无菌接种环取适量菌液接种于含卡那霉素的LB固体培养基内，37七恒温培养箱倒置过夜。无菌接种环挑选固体培养皿上的单菌落，接种r200L含卡那霉素的LB液体培养基中，37C摇床，200rpm,培养八小时后岸置待用。1.2.4 重组质粒pVAXl-SG的提取:按照天根试剂盒提取质粒的步骤对质粒进行提取,并通过紫外分光光度计测量其纯度（OD260、OD280）及浓度，如表L*1*姐质粒PVAXLSG11取浓度Tab.lExtractionconcentrationofrecombinantplasmidpVAXl-SGA260A280纯收（A26OA28O>i<UK<ngul）14J837XM62QI7Q9J61.3 RNA提取、测序、分析一每个样本编号，按照RNA提取试剂盒说明书分别提取总RNA。使用Agilent公司21型生物分析仪配试剂盒（AgiIenlRNA6000NanoKit）检测总RNA的浓度、28S/18S值、RNA完整值（RlN）以及片断大小。每个样本总RNA单独建麻，构建好的文库用Agilcnt21Bioanalyzcr和ABIStcpOnePlusReal-TimePCRSyStem质检合格后进行ReSeqUenCingIlluminaHiSeq2000测序。过滤掉低质JR、接头污染以及未知碱基N含量过高reads（SOAPnuke-V1.5.2）.获得高质量数据后，比对到人参考基因组上（HISAT2-v2.04）,然后用StringTie对每个样品分别进行转录本的重构，用Cuffmerge将所有样品的重构信息整合在一起，对整合后的数据再使用CUffcOmPare采集、比较和整合。2.1 pVAXI-SCi质粒提取及测序殴证将提取的质粒送SangOnBi。IeCh测序，结果如图1所示，序列峰图清晰有序，主峰明显，由于一个测序反应只能测到IooObP左右，pVAXl-SG的两个重要毒力功能区SpaP/A-CAT基因大小为1.8kb。对于PCR样品测序结果测到PCR终止末端的A减基，显示测序结果正常100%,真实可信（如图1）。图1pVAXI-SG质粒测序结果Fig.1SequencingresultsofpVAXl-SGPlaSmid2.2 实险样本的采集在免疫后7天采集乳腺（乳头周围ICm的范围，包埋于皮下组织中）后生理盐水冲洗，装入无菌、无醉EP管，并放入液缸速冻后80CC保存（图2和图3）。图2经肌肉注射DNA疫苗免疫SD大鼠Fig.2ImmunizationofSDratsbyintramuscularinjectionofDNAvacc