防龋DNA疫苗pVAX1-SG免疫下大鼠乳腺FcRn的表达研究.docx
I防弱DNA疫苗pVAXl-SG免疫下大鼠乳腺FcRn的表达研究I邹潇龙I王月月2,吴砧冰3,犹然淞4,周民希"陈彬"(1.遵义医科大学口腔疾病研究特色重点实般室,贵州遵义5630062.遵义医科大学附属口腔医院,贵州遵义5630)I摘要I目的:本研究在SD大鼠不同生理阶段以及免疫条件下分析乳腺FCRn基因mRNA表达量的变化,探索防隔DNA疫苗 PVAXlSG对大鼠乳腺FCRn表达的影响,方法:将40只雌性受孕SD大鼠随机分成四蛆(防般DNAI5苗组,空戟质粒蛆,生理 盐水组,空白对照组),在其分娩后第I天及第1周分别用对应试剂进行注射,第2周处死SD大鼠并取乳腺迸行mRNA检测.结 果:经防踽DNA疫苗pVAXlSG免疫后的大鼠乳腺FCRn基因表达量较正常组大鼠乳腺FCRn基因表达量显著上升(p<0.05). 结论:防lDNA疫苗PVAXl-SG可以提高大鼠乳腺RRn的表达.I关健词I防舒DNA疫苗;乳腺FCRn;免疫表达;Anthcaries DNA vaccine pVX 1 SG immunized rat mammary FcRn of expression researchZom Xiaolong i. l%"g Yueyue2.Wu MingrUi3, You Lausng4.Zhou Chexi5.Che> Bin I*. (I. Key Laboratory Of Oral Disease Resean h, Zunyi Medical University, Zunyi 563006, China: 2. Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Znnyi 563000, China )Abstract Objectives Herein, in order to vxpl<>rc the effects of anti-caries DNA vaccine pVAXl-SG on the expression of nits批注IAW请补充:第一作者:姓名(年份),性别, 职称,主要研究方肉通讯作者;姓名(年份),性别,职称,主要研究方 向t E-mail TTt投稿论文的题目、摘要、关健词、图题、表题、图注、 表注以及中文参考文献必须有中英文对照(中文汇献、二; 娈翻译的(本身就有英文翻译的再翻译,本身无英文翻 译的保留中文就可),请先列出英文同译后是中文批注A2:知网13.4%万方37.82%.文章现制率较高请修改至20以下,引用他人文字 部分可换种表达方法,或者正文相应增加些内容,复 制率均可下降,如要自行查受制率请剔除摘要和文献. 只杏正文部分breastFcRn,thechangesofmRNAexpressionobreastFcRngeneinSDratsWereanalyzedatdiferentphysiologicalstagesandunderimmuneconditions.Methods40fcmalc-conceivedSDratxwererandomlydividedintofourgroupswhichwereIabclsanti-VariesDNAvaccine,emptyplasmid,physiologicalsaiincwandblankcontrolgroups.Atthefirstday.thestudiedrateswereimmunizedwithcorrespondingreagents,respectively.Subsequently9afterthedeliver)'forIweek,theSI)ratswereexecutedandthemammaryglandwastakeninthesecondweekfordetection.ResultssTheexpressionofFcRngeneinthemammaryglandsafterimmunizationwiththeanti-cariesDNAvaccinepVAXl-SGassignificantlyhhcrthanthatofthenormalg)pofrats(p<0.05).ConclusionsTheanti-cariesDNAvaccinepVAXl-SGcanincreasetheexpressionofFcRninrats'InHInmaryglands.Keywords)nti-cariesDNAvaccine;BreastFcRnzImmuneexpression;FcRn是一种位于细胞膜表面的IgG抗体受体,其蛋白结构和MHC-I分子类似,主要在内皮细胞中表达,其结构包含由链和。2微球蛋白组成的异二聚体FcRn可以和IgG的Fc部分结合,阻止IgG分子被溶酶体裂解,可以起到增长IgG体内半衰期的作用,参与到IgG的体内转运、维持和分布代谢过程中ULFCRn作为将IgG从母体传递到幼崽体内的特异性载体,WallaCe和ReeS在啮齿类动物刚出生的幼崽小肠上皮细胞刷状缘上首次分离得到。FCRn在许多成年哺乳动物的呼吸道、消化道和生阳道的黏膜上皮细胞及肺脏、肝脏、肾脏、胎盘及乳腺等组织都有表达a”FCRll与IgG在酸性环境中结合,在中性环境解离,其相互作用具有PH值依赖性二因此,IgG从组织间隙液中流经乳腺上皮细胞过程中,在腺泡上皮细胞的基底侧与酸性环境中的FcRn结合,经胞吞转运释放到腺胞腔中。防僦DNA疫苗免疫后产生的抗体在许多哺乳动物比如小鼠的肾脏、肝脏、血管内皮细胞等组织器官都有表达网。FCRn在不同动物中传递母体IgG的途径不同。比如:在人和兔子中主要通过胎盘内转运母体的IgG分子,在乳汁中则几乎不含IgG;在啮齿类动物中一部分可以通过胎盘中的FcRn转运母体IgG分子,部分可以通过乳腺中的FcRn转运IgG.FCRn可以调控血清中IgG的浓度,当IgG少的时候,与IgG结合可以保护其不被体内溶菌满降解,延长IgG的半衰期I'。L益金项目I步州有普通ItJi等学校青年科技人才成长项目(髀科鲁KY字20221276号九贵州省普通四等学校为年科技人才成长项目<黔科合KY字2O22289号L费州省卫生做康委科学技术珞金项目<szwkj202l-351).i®义法科大学大学生创新创业VH炼计划项U(ZYDCiZYDC),胃州省科技计划项H(评科合基础2O2O)IY292通倡作者:陈彬TebEmail:DNA疫苗是一种灵活且全面的抗原递呈系统,本课题组前期构建的口腔疾病DNA疫苗对机体可以起到免疫增强和抗原递呈的双重功能,能同时剌激体液免疫及细胞免疫,能显著增强T细胞增殖、分化,诱导多种亚型的特异性抗体产生,引起多种动物对多种抗原产生高滴度的抗体应答。防降DNA疫苗免疫后产生的抗体在许多哺乳动物比如小鼠的肾脏、肝脏、血管内皮细胞等组织器官都有表达UL课题组前期研究发现在口腔防断DNA疫苗免疫条件下大鼠乳汁中IgG含量提高,FCRn作为将IgG从母体传递到幼患体内的特异性载体,IgG的增高是否是由于乳腺内FCRn基因表达变化所致,目前并没有此方面的研究报道。因此,本实验将不同生理状态下的受孕SD大鼠用不同的试剂进行免疫。探索防醯DNA疫苗是否可以提高大鼠乳腺FcRn的表达。I材料与方法主要试剂1.B肉汤培养基(北京索莱宝科技有限公司,中国),培养皿(北京索莱宝科技有限公司,中国),卡那毒素溶液(北京索莱宝科技有限公司,中国),无内锋素质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司,中国),防耦DNA疫苗PVAXI-SG(课题组前期构建)。1.1 方法1.1.1 实验动物及分组健康的雉性SD大歌20只,(体重30Og左右):健康的雌性SD大鼠60只(体重30Og左右);每1只公鼠笼中放入3只雌鼠进行交配受孕。第二天检杳阴道栓,有阴道栓的可以计为妊娠1山选择有阴道栓记录时间和腹部明显变大的雌鼠作为怀孕大鼠共40只,随机分为四组:防龊DNA疫苗组,空载质粒组,灭菌生理盐水组,空白对照组:在大鼠分娩的Id和7d分别注射相应试剂:防鹤DNA疫苗,空载质粒、灭菌生理盐水,空白对照组不处理。在第二次免疫后7天采集乳腺后生理盐水冲洗,装入无菌、无酶EP管放入液氮速冻后.80C保存。122主要试剂的配制LB液体培养基的配制:按照每100ml液体加入LB粉末2.5g的比例配置,高压锅灭国,待液体降温到506Ot时,于超净台中按照每20OmL的液体加入卡那寄素溶液60-80L的比例加抗生素,LB固体培养基的配制:按每IOomL液体加入25gLB与Ig琼脂粉的比例配置,配置完成后经高压锅灭菌,待液体降温到50-60C时,于超净台中按照每200mL的液体加入卡那霉素溶液60-80L的比例加抗生素,倒入培养皿中,待其自然凝固。123菌种的豆苏将有重组质粒PVAXl-SG的大肠杆菌菌种解冻、豆苏、培养:取出-80'C条件下保存的大肠杆菌,置于超净台内用无菌接种环取适量菌液接种于含卡那霉素的LB固体培养基内,37七恒温培养箱倒置过夜。无菌接种环挑选固体培养皿上的单菌落,接种r200L含卡那霉素的LB液体培养基中,37C摇床,200rpm,培养八小时后岸置待用。1.2.4 重组质粒pVAXl-SG的提取:按照天根试剂盒提取质粒的步骤对质粒进行提取,并通过紫外分光光度计测量其纯度(OD260、OD280)及浓度,如表L*1*姐质粒PVAXLSG11取浓度Tab.lExtractionconcentrationofrecombinantplasmidpVAXl-SGA260A280纯收(A26OA28O>i<UK<ngul)14J837XM62QI7Q9J61.3 RNA提取、测序、分析一每个样本编号,按照RNA提取试剂盒说明书分别提取总RNA。使用Agilent公司21型生物分析仪配试剂盒(AgiIenlRNA6000NanoKit)检测总RNA的浓度、28S/18S值、RNA完整值(RlN)以及片断大小。每个样本总RNA单独建麻,构建好的文库用Agilcnt21Bioanalyzcr和ABIStcpOnePlusReal-TimePCRSyStem质检合格后进行ReSeqUenCingIlluminaHiSeq2000测序。过滤掉低质JR、接头污染以及未知碱基N含量过高reads(SOAPnuke-V1.5.2).获得高质量数据后,比对到人参考基因组上(HISAT2-v2.04),然后用StringTie对每个样品分别进行转录本的重构,用Cuffmerge将所有样品的重构信息整合在一起,对整合后的数据再使用CUffcOmPare采集、比较和整合。2.1 pVAXI-SCi质粒提取及测序殴证将提取的质粒送SangOnBi。IeCh测序,结果如图1所示,序列峰图清晰有序,主峰明显,由于一个测序反应只能测到IooObP左右,pVAXl-SG的两个重要毒力功能区SpaP/A-CAT基因大小为1.8kb。对于PCR样品测序结果测到PCR终止末端的A减基,显示测序结果正常100%,真实可信(如图1)。图1pVAXI-SG质粒测序结果Fig.1SequencingresultsofpVAXl-SGPlaSmid2.2 实险样本的采集在免疫后7天采集乳腺(乳头周围ICm的范围,包埋于皮下组织中)后生理盐水冲洗,装入无菌、无醉EP管,并放入液缸速冻后80CC保存(图2和图3)。图2经肌肉注射DNA疫苗免疫SD大鼠Fig.2ImmunizationofSDratsbyintramuscularinjectionofDNAvacc