蛋白质的相互作用研究方法.ppt

两个或两个以上的蛋白质结合在一起执行生物学功能时，发生相互作用。使蛋白质到发挥作用的位点。使蛋白质的构象发生改变，激活或抑制。蛋白质蛋白质相互作用和识蛋白质蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。命过程起着重要的作用。第三节第三节 蛋白质的相互作用的研究方法蛋白质的相互作用的研究方法免疫共沉淀免疫共沉淀Co-immunoprecipitation(Co-IP)GST pull-down assay荧光共振能量转移荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer（FRET）双分子荧光互补（双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC酵母双杂交系统酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm其它方法其它方法1.原理原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质了下来。如果用蛋白质X X的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀X X，那么与，那么与X X在体内结合的蛋白质在体内结合的蛋白质Y Y也能沉淀下来。这种方法常用也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。优点：生理条件下的结合优点：生理条件下的结合缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用作用一、免疫共沉淀一、免疫共沉淀2.方法方法1)收获培养的细胞（收获培养的细胞（11071108）冷）冷PBS洗涤洗涤2次次2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min3)12000rpm 离心离心 30min4）收集上清并加入适量抗体，）收集上清并加入适量抗体，4C摇动摇动1h过夜过夜5）加入）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶)悬液，悬液，4C摇动摇动1h6）细胞裂解液洗涤）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液混合液7）离心弃上清）离心弃上清8）沉淀加）沉淀加2蛋白蛋白Loading Buffer煮沸煮沸510min9）离心，上清液跑）离心，上清液跑SDS-PAGE 胶胶10）考马氏亮兰染色、银染）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析质谱分析3.注意事项注意事项1）细胞裂解）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（变性剂（NP40或或Triton X-100)。每种细胞的裂。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。沉淀。3)对照实验的设计。对照实验的设计。二、二、GST融合蛋白进行融合蛋白进行Pulldow实验实验 1 原理原理 细菌表达的谷胱甘肽细菌表达的谷胱甘肽s转移酶（转移酶（GST）融合蛋）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。外的相互作用。两种应用：两种应用：1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 2 方法：方法：1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明单一明确的重组蛋白；确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）表达得到的未知蛋白）2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4C 2h 3）离心弃上清）离心弃上清 4）沉淀加入）沉淀加入2 蛋白蛋白Loading Buffer煮沸，离心煮沸，离心 5）取上清进行）取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳，6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：该实验设立注意：该实验设立GST对照，反应均在对照，反应均在4C进行进行GST-Pulldown Assay三、三、Fluorescence resonance energy transfer1.1.荧光信号的产生荧光信号的产生 荧光基团在某波长的激发光刺激下，产荧光基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。生一个更长波长的发射光。什么是什么是FRET?FRET?当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移光共振能量转移(FRET),(FRET),实际相当于将短波长荧实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。光基团释放的荧光屏蔽。3.绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 60年代，年代，Shimomura等首先从水母等首先从水母（Aequoria Victoria）中分离出一种）中分离出一种水母发光水母发光蛋白蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即光蛋白即绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 GFP,后经研究表明，后经研究表明，在水母体内在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光在蓝光的激发下，产生绿色荧光的激发下，产生绿色荧光。Osamu Shimomura Osamu Shimomura in the lab in the basement of his home.He is holding a sample of“real”GFP isolated from Aequorea victorea,not produced by bacteria.In order to do his research Shimomura estimates that he collected over a million Aequorea specimens。（One Aequorea weigh about 50g）William Ward(right)met Douglas Prasher on a jellyfish-hunting expedition in the 1980s Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule.GFP could be used to report when a protein was being made in a cell.GFP could potentially be a very useful reporter molecule.容易检测分子量小 不需要其它底物Douglas Prasher 1992 克隆了克隆了GFP基基因因Chalfie 将GFP基因转入大肠杆菌中。Sergey A.Lukyanov 在珊瑚中发现了类似GFP的蛋白。他还发现了红色荧光蛋白。Roger Tsien 对对GFP的机理作的机理作出了贡献。制造出了贡献。制造了很多了很多GFP突变突变体。体。GFPsequence MSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSHNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYKhttp:/ 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达程中或外界刺激因子的作用下的时空表达,如某种转录因子如某种转录因子的核转位、蛋白激酶的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。的膜转位等。GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞,可动态观察可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程该分泌蛋白分泌到细胞外的过程 GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程。器的结构及病理过程。膜蛋白的移动膜蛋白的移动（Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP）蛋白之间的相互作用（蛋白之间的相互作用（FRET）报告分子报告分子 将将GFP的基因连在特殊的启动子的后面，可以检的基因连在特殊的启动子的后面，可以检测基因表达的时间和部位。测基因表达的时间和部位。人们在人们在GFP基因的基础上已经制造出基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白蛋白，又发现了红色荧光蛋白。其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移生荧光共振能量转移Look at physical interactions between proteins四、Bimolecular Fluorescent Complementation五、五、Yeast TwoHybrid Systerm1.原理原理 酵母双杂交系统由酵母双杂交系统由Fields和和Song等首先在研究真等首先在研究真核基因转录调控中建立。核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，典型的真核生长转录因子，如如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域等