酶联免疫间接法检测新型冠状病毒S蛋白抗体方法的建立及评价.docx

酶联免疫间接法检测新型冠状病毒S蛋白抗体方法的建立及评价曾小平I裴华2朱中元心海南医学院第二附属医院海口570311作者简介：曾小平女检验医师主要从事免疫细胞临床应用研究。朱中元，Email:摘要目的：为建立新型冠状病毒抗体的快速检测方法，用于辅助新冠肺炎诊断及评价疫苗效果。方法:以新冠病毒S蛋白为包被抗原，棋盘滴定法确定包被抗原及样本血清的最佳浓度，通过优化ELISA实验条件，建立起检测新冠病毒抗体ELlSA间接法。以阴性血清确定临界值，并对该法特异性、敏感性、重复性进行验证。结果:棋盘滴定法确定S蛋白包被浓度和样本血清分别为6.4ug/ml和1:100,酶标二抗最适条件为1：1000作用Ih,样品和显色液的作用时间分别为45min和30min,CutOff值为0.224。85份新冠疫苗免疫者血液，ELlSA间接法阳性率75.3%(64/85),化学发光法阳性率71.8%(61/85),两者间阳性符合率为85.2%,阴性符合率为50%,总符合率为75.3%批内变异系数<5%,批间变异系数<15%,结论：以S蛋白为包被抗原建立起的ELISA间接法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于新冠一面免疫效果评价。关键词：新型冠状病毒；新型冠状肺炎；S蛋白；ELlSA间接法DevelopmentandEvaluationofAnIndirectEnzymeImmunoassayforDetectingSARS-CoV-2SpikeProteinAntibodiesZengXiaoping1,PeiHua2,ZhuZhongyuanizTheSecondAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,HaiKouHainan57031IchinaAbstractObjective:toestablisharapiddetectionmethodofSARS-CoV-2antibodiestoassistinthediagnosisofCOVID-19andevaluationtheefficacyofCOVID-19vaccine.Methods:UsingSARS-CoV-2Spikeproteinasancoatingantigen,andthebestconcentrationoftheantigenandsampleserumwasdeterminedbychessboardtitration.Byoptimizingtheexperimentalconditions,anindirectELISAmethodfordetectingSARS-CoV-2antibodywasestablished.Thecutoffvaluewasdeterminedbynegativeserum.Thespecificity,sensitivityandrepeatabilityofthemethodwereverified.Results:thecoatingantigenofSproteinandsampleseradeterminedbychessboardtitrationwere6.4gmland1:optimaldilutionofHRP-conjugatewas1:1000whenreactingfor1reationtimeofsampleandchromogenicsolutionwas45minand30min,andthecutoffvaluewas0.224.FromtheCOVID-19vaccineimmunizedsamples,thepositiveratesofELISAindirectmethodandchemiluminescencemethodwere75.3%and71.8%.Respectively,thepositiveagreementratebetweenthemwas85.2%,thenegativeagreementratewas50%,thetotalagreementratewas75.3%.theintra-assaycoefficientofvariationwas<5%,andtheinter-batchcoefficientofvariationwas<15%.Conclusion:TheindirectELISAassayusingSproteinascoatingantigenhasgoodspecificity,sensitivityandreproducibility,fordetectionofSARS-CoV-2antibody.Keywords：SARS-CoV-2;COVID-19;Spikeprotein;ELISA目前全球疫情形势严峻，截止2021年1月31日，全球确诊新冠肺炎超过1亿人，中国累计确诊89564人,累计死亡人数4636人,全球累计确诊病例超过1亿。面对疫情的威胁，疫苗免疫是预防和阻断病毒感染的有效措施。从2021年1月伊始，重点人群开始分批接种的新冠肺炎疫苗，2021年2月全民开始免费预约接种新冠肺炎疫苗。为检测注射疫苗后是否产生有效抗体的情况，需要用到特异性免疫血清学检测方法。中和抗体检测的金标准是噬斑减少病毒中和试验，此方法涉及活病毒培养，对实验室生物安全级别高且费时并难以大规模快速检测，因此需要简单、快速和批量检测的方法。本研究通过以新型冠状病毒S蛋白为包被抗原，通过优化实验条件，从而建立起ELISA间接法，并和商品化磁微粒化学发光法比较检测新型冠状病毒疫苗接种后IgG抗体阳性率。1资料与方法1.1 一般资料临床实验组：选取我院2021年Ol月-2021年02月完成新冠灭活疫苗第二针剂接种的健康体检者85例，其中男性27例，女性58例，年龄范围为18岁59岁。接种者均符合国家新冠肺炎疫苗接种适应症,接种的新冠肺炎疫苗第一针为武汉生物制品研究所有限责任公司生产，第二针为北京生物制品研究所有限责任公司生产。疾病对照组：临床诊断明确的社区获得性肺炎、慢性阻塞性肺炎、继发性肺结核、肺部恶性肿瘤的住院患者各24例及通过间接免疫荧光法（HF）明确24例肺炎支原体IgM阳性、4例副流感病毒IgM阳性和2例乙型流感病毒IgM阳性的住院患者。干扰对照组：从新冠核酸检测阴性的住院患者中选取人为震荡破坏20例溶血、20例脂浊以及18例黄疸的标本；按我院检验科临床生物化学室制定的实验参考值为临界值，在全自动生化分析仪中选取20例单项C反应蛋白>6mgL（参考值为0-6mgL）、11例单项类风湿因子>20IUmL（参考值为0-20IUmL）、12例单项补体>1.4g/L（参考值为0T.4g/L）、2例单项抗链球菌溶血素0>200lU/mL（参考值为0-200lUmL）的临床标本。阴性对照组：50例在体检科体检无心、脑、肺、肝等重大疾病的健康体检者。1.2 仪器与试剂新型冠状病毒S蛋白（杭州启泰）；酶标二抗羊抗人IgG-HRP（杭州华得森）ELISA板（上海田源），酶标仪（上海帝肯，型号SUNRlSE）；电热恒温培养箱（北京赛多利斯，型号DHP-42OA）；低速离心机：（安徽中科中佳，型号KDCTO44）；化学发光免疫仪（天津博奥赛斯，型号AXCeed260）和配套的抗体检测试剂盒：其余试剂为实验室现配现用。1. 3方法1.3. 1建立ELlSA间接法1. 3.1.1最佳抗原包被浓度及阳性血清稀释度的确认用0.05molLpH9.6碳酸盐缓冲液将新型冠状病毒S蛋白分别稀释为12.8、6.4、3.2.1.6HgmL,采用棋盘滴定法将S蛋白不同浓度的稀释液加入ELISA板中，100uL/孔，每个浓度做16个孔，4过夜后用200ULPBST溶液洗涤3次，3min孔,加入200uL5%BSA封闭液37°C孵育Ih,洗涤方法同上；用0.Imol/LPBS按1：100的比例稀释阳性血清和阴性血清，分别加入不同浓度的ELlSA实验方阵，各100UL/孔，重复做2个孔，孵育方法同上;用0.lmolLPBS按1:1000的比例稀释羊抗人IgG-HRP,100UL用L,同种方法孵育及洗涤后加入显色液A和B各50UL/孔,37C孵育30min后按100口L/孔加入10%HzSOq终止液终止显色，用酶标仪OD网检测，取每个浓度的0怯5。值的平均值。根据OD仅值计算相应的P/N值，当阳性样品OD伽值（P）比阴性样品OD曲值（N）的最大值为最适抗原浓度和血清稀释浓度。1.3.1.2酶标二抗最佳稀释倍数及作用时间的确定以选定的抗原包被浓度和阳性血清稀释度，将羊抗人IgG-HRP用0.lmolLPBS液按1:500、1:1000、1:2000倍稀释，分别加入3块ELlSA板中，37C作用30min、60mir90min,后用酶标仪OD网检测，计算P/N值，取P/N最大值作为最适稀释浓度和作用时间。1.3. 1.3CutOff值的确定在选定条件下，对50份健康体检患者血清进行检测，每份标品重复加2个孔，用酶标仪ODi50进行检测，取OD划平均值，计算所检测样的平均值（X）和标准差（三）,以ODQD值，X+3S计算的值作为CUtOff值。1.4. 1.4交叉性和干扰性实验选取临床诊断明确的社区获得性肺炎、慢性阻塞性肺炎、继发性肺结核、肺部恶性肿瘤的各24例患者血清，通过间接免疫荧光法（IIF）明确29例肺炎支原体IgNk4例副流感病毒IgM.2例乙型流感病毒IgM阳性血清；从住院患者选取20例人为震荡破坏溶血标本、20例脂浊标本、18例黄疸标本、20例C反应蛋白、11例类风湿因子、12例补体、2例抗链球菌溶血素O均升高的临床标本进行检测。1.3.1.5重复性实验批内重复性试验：选择同一时间包被的同一块ELISA板,用本实验建立的ELISA方法同时检测同一批阳性对照品和阴性对照品，每种样品各重复做20孔，计算批内变异系数。批间重复性试验：取3块不同时间包被的ELlSA板,分别编号为1、2、3,分别用同一批阳性对照品和阴性对照品在ELISA板上重复10孔，计算批间变异系数。1.3.1.6临床标本检测应用本实验建立的ELISA间接法，对85例完成新冠灭活疫苗第二针剂接种的健康体检者的血清进行检测，并与化学发光法检测的结果进行比较。1. 3.2样本采集标本为清晨空腹状态下,干燥管抽取肘静脉血35mL,在2h内4000rpmmin速度离心5min,分离血清后立即采用ELISA间接法与化学发光法同时进行检测。1.3.3结果阳性判断酶联免疫间接法：OD伽值2X+3S；化学发光法:SC01.0o1.4统计方法计数资料以阳性数、阴性数或百分率表示，在对ELISA间接法和化学发光法结果的比较时采用配对资料2检验，交叉性试验和干扰性实验采用四格表资料2检验，结果以产0.05则差异显著，有统计学意义。2结果2. 1ELlSA间接法反应条件经过多次实验数据表明，血清最适稀释比例为1:100,棋盘滴定法确定S蛋白最适反应浓度为6.4口gd（见表1）,酶标二抗最佳稀释度和时间为1：1000时作用Ih,最佳样品和显色液的作用时间分别为45Inin和30min,CutOff值为0.224。表1不同S蛋白包被浓度和血清稀释浓度P/N值稀释倍数血清S蛋白包被浓度（ugmL）1.63.26.412.81:25P/N2.332.1412.0762.8861:50P/N1.8792.4974.0352.0821:100P/N2.0073.5115.1402.1361:200P/N1.8243.9923.8321.7942. 2交叉性和干扰性实验应用本实验建