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P-防御素-3在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎大鼠肺组织中的表达1华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，武汉430022武庆平桂平姚尚龙【摘要】目的研究大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）呼吸机相关性肺炎（VAP）时肺组织中-防御素-3（BD-3）的表达，以探讨其在VAP发病机制中的作用。方法20只清洁级雄性SD大鼠随机分为2组（n=10）,非通气肺炎组（N组）和呼吸机相关性肺炎组（V组）。N组大鼠经口气管插管后立即接种2x109菌落形成单位（Cm）的MRSA,V组大鼠经口气管插管并进行4h保护性机械通气后气管内接种相同数量的细菌。接种后48h处死大鼠，测定肺湿重与体重比（WW/BW）,记录肺肉眼和病理学评分，并进行肺组织细菌计数和脾培养，免疫组化检测肺组织BD-3的表达。结果与N组比较，V组WW/BW,肺病理学积分，肺组织细菌含量和菌血症发生率均显著升高（P均<0.01）,而BD-3的表达显著降低（P<0.01）。结论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎（MRSAVAP）显著重于非通气肺炎，这可能与机械通气降低了BD-3的表达有关。【关键词】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；呼吸机相关性肺炎；防御素Expressionofbeta-defensin-3inlungsofratswithmethicillin-resisitantStaphylococcusaureusventilator-associatedpneumoniaGUIPingDepartmentofAnesthesiology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,ChinaAbstractObjectiveTostudytheexpressionofbeta-defensin-3（BD-3）inlungsofratswithmethicillin-resisitantStaphylococcusaureus（MRSA）ventilator-associatedpneumonia（VAP）andtoinvestigatetheroleofBD-3inthepathogenesisofVAP.Twentyspecificpathogen-freemaleSprague-Dawleyratsweighing242286gwererandomlydividedinto2groups:nonventilatedpneumoniagroup（groupN,n=10）andventilator-associatedpneumoniagroup（groupV,n=10）.RatsingroupNwereinfectedintrabronchiallywith2×109colony-formingunits（cfu）MRSAI作者单位：430022武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科immediatelyafteroralintubationwhileratsingroupVwereinfectedintrabronchiallywiththesameamountofMRSAafteroralintubationand4hours,protectivemechanicalventilation.Ratsfrombothgroupswerekilled48hafterinoculation.Lungwetweighttobodyweightratios（WWBW）weremeasured,lungmacroscopicandmicroscopicscoreswererecorded,lungbacterialcountsandspleenculturewerealsodone.ExpressionofBD-3inlungofratswasdetectedbyimmunohistochemistrystaining.ResultsWWBW,lungmicroscopicscore,bacterialpulmonaryconcentrationandtheincidenceOfbacteremiaingroupVweresignificantlyhigherthaningroupN（P<0.01）,whileexpressionofBD-3wassignificantlylowerthaningroupN（P<0.01）.ConclusionVentilator-associatedpneumoniaismoreseverethannonventilatedpneumonia,thismayberelatedtothereducedexpressionofBD-3bymechanicalventilation.Keywordsmethicillin-resisitantStaphylococcusaureus;pneumonia,ventilator-associated;defensin呼吸机相关性肺炎（VAP）是重症监护室最重要的感染并发症，接受机械通气的病人8%-28%会并发VAP,其死亡率高达24%-50%W°VAP治疗失败率如此之高的原因之一就是多重耐药病原体的感染，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是VAP常见的多重耐药病原体。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎（MRSAVAP）已成为重症监护室里的一大挑战。-防御素-3（BD-3）是防御素家族中的一个成员，是上皮细胞分泌的一种重要的固有免疫效应分子，具有广谱高效的抗微生物活性，包括多重耐药的金黄色葡萄球菌，BD-3还能趋化单核细胞。本实验拟建立MRSAVAP的大鼠模型，观察BD-3表达的变化，探讨BD-3在MRSAVAP发病机制中的作用。材料与方法MRSA临床分离株（华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科）；蛋白月东、酵母粉、琼脂粉（OXOid公司，英国）；小鼠抗人BD-3单克隆抗体（immundiagnostik公司，德国）；SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；683型小动物容量控制呼吸机（HarVardAPParatUS公司，美国）；HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统（武汉千屏影像技术有限责任公司）。MRSA临床分离株接种于液体LB培养基（1%蛋白胺、0.5%酵母粉、1%氯化钠），于37°C220rpm的恒温摇床振荡培养79h,取菌液0.1ml,用液体LB培养基进行10倍系列稀释，各取0.1ml接种于固体LB培养基（1%蛋白膝、0.5%酵母粉、1%氯化钠、2%琼脂粉），于37。C的细菌培养箱培养24h后计算菌液的浓度，用生理盐水稀释成IOiOcfiVml备用。清洁级雄性SD大鼠20只，体重242286g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，随机分为2组（n=10）：非通气肺炎组（N组）和呼吸机相关性肺炎组（V组）。腹腔注射20%乌拉坦1.3g/kg麻醉后，N组大鼠直视下应用额镜经口气管插管（16G2”的静脉套管针代替气管导管），确认导管在气管内后，经气管导管注入0.2mlIO】。CfWnll的菌液，拔出气管导管；V组大鼠直视下应用额镜经口气管插管，确认导管位置正确后，连接到683型小动物容量控制呼吸机进行保护性机械通气，通气参数设置如下：潮气量6mlkg,呼吸频率88次min,呼气末正压5cmH2O,吸入氧浓度21%,大鼠口腔填塞纱布条以防止漏气，通气4h后经气管导管注入0.2ml1010cfuml的菌液，拔出气管导管。2组大鼠均于接种后48h处死。处死大鼠前称体重（BW）,开胸完整分离出肺并称重（WW）,计算肺湿重与体重比（WW/BW）。记录肺肉眼评分，每一叶的评分按以下标准进行：正常（0）,瘢痕（1）,轻度充血（2）,红色充血（3）,灰色充血（4）和浅黄色充血（5）久从每一叶肺（左肺、右肺前叶、右肺中叶、右肺后叶和右肺副叶）固定位置各取ICm左右大小的组织块，用于组织病理学和免疫组织化学检测，肺组织浸于4%的多聚甲醛固定，于一系列浓度梯度的乙醇中脱水，石蜡包埋、切片，一部分切片HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变，组织病理学评分按以下标准进行：正常（0）,脓性粘液栓（1）,支气管炎（2）,支气管肺炎（3）,融合性支气管肺炎（4）和肺脓肿（5）。另一部分切片用于免疫组化法检测肺组织BD-3表达，DAB染色，阳性染色为胞浆染成棕黄或棕褐色。阴性对照采用PBS代替一抗。每张切片随机选取5个视野（×200）,图象采用HMIAS-2000型全自动彩色图像分析系统进行蛋白半定量分析，以光密度反映BD-3蛋白含量。余下的肺组织称重后加Iml生理盐水匀浆，取匀浆液0.1ml10倍系列稀释后培养计数，肺组织细菌浓度以IOgIOCfig肺组织表示。分离出脾脏后，无菌生理盐水冲洗，匀浆后涂抹接种于LB琼脂平板，如有菌落生长，挑取菌落革兰染色，排除假阳性，真阳性表明发生了菌血症。采用SPSSlo.0统计软件分析数据，计量资料以均数土标准差（用±s）表示，组间比较采用独立样本方检验，菌血症发生率的比较采用M检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果2组大鼠发生的都是双侧不对称多病灶性肺炎，病变多以右肺后叶最为严重，见图1。V组肺炎较N组重，无论是组织病理学方面还是细菌学方面。与N组比较，WW/BM和病理学评分显著升高（尸均<0.01）,肉眼评分无显著差异（QO.05）,见表1,肺细菌浓度和菌血症发生率也显著升高（尸均<0.01）,见表2。图12组右肺后叶病理学结果（HE染色，200）表12组WW/BM,肉眼评分和病理学评分的比较（n=10,X±s）组别WW/BW（×102）肉眼评分病理学评分N组0.99±0.1112.1±1.511.7±1.2V组1.21±0.10*12.6±1.313.4±1.2*与N组比较，*P<0.01表22组肺细菌浓度和菌血症发生率的比较(n=10,X±s)组别肺细菌(logocfig)浓度菌血症发生率N组8.7±0.420%(210)V组12.2±0.9*90%(910)*与N组比较，*P<0.01BD-3主要表达于支气管上皮细胞和肺上皮细胞，见图2。N组和V组的平均光密度值分别是L16±010和0.77±0ll,与N组比较，V组的BD-3表达显著降低(jp<0,01)o图22组右肺中叶BD-3的表达(DAB显色，×200)讨论VAP是重症监护室最重要的感染并发症，MRSAVAP成为一重大挑战。VAP的病理学特点是双侧不对称多局灶性肺炎，尤以下肺最为严重，不同阶段的病变共存向。VAP是感染和呼吸机相关性肺损伤共同作用的结果。预实验发现经气管接种108或109Cm的MRSA引起的肺炎病变较轻，而经气管接种2l09Cm的MRSA引起的肺炎病理学改变符合VAP病理学特点，所以本实验采用经气管接种2l09CfiI的MRSAo本实验采用的通气模式在原先的基础上刀进行了改进，采用的是小潮气量加呼吸末正压通气保护性通气，一是因为大潮气量通气能导致明显的肺损伤，小潮气量加呼吸末正压通气是重症监护室最常用的通气模式，因而更贴近临床，二是因为新的小动物呼吸机能达到这种要求。VAP的评估主要从病理学和细菌学两方面进行，与N组比较，WW/BM,病理学评分，肺细菌浓度和菌血症发生率均显著升高，表明4h的保护性通气后经气管接种2l09Cftl的MRSA能成功制作MRSAVAP大鼠模型。BD-3是重要的抗微生物肽，在肺的固有免疫中发挥重要作用。低浓度的BD-3能杀灭革兰阴性细菌（大肠埃希菌，铜绿色假单胞菌），革兰阳性细菌（金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌