花生疮痂病菌毒素对活性氧产生动态及细胞凋亡的作用机制.docx

第四章花生疮痂病菌毒素对活性氧产生动态及细胞凋亡的作用机制4.1 材料与方法4.1.1 供试菌株4.1.2 毒素提取4.1.3 接种处理供试花生品种白沙1016的种子精选后，播种在直径IoCm的小花盆中，温室中进行培养。待花生第叶完全展平后（78d）,用毛笔将花生疮痂病菌菌悬液接种到叶片正面.毒素接种采用注射装置的小室扣住叶片，将一定浓度的毒素注射进入叶片内部，空白对照用无菌水及毒素溶剂，然后在25*C黑暗条件卜.保湿24h,取出置于常规条件卜培养。茎秆做相同处理。离体接种：叶片（毒素原液，乙酸乙酯，无菌水）烟草接种，取健康，生长势相同烟草叶片，打取直径为ICm的叶圆片，去除叶脉抽真空3min,浸泡在已知浓度的毒素溶液中。毒索接种两个处理，对比毒索的致病作用.4.1.4 花生活性气原位检测4.1.4.1 过氧化氢检测H2O2与DAB（二氨基联苯胺）反应形成红棕色染色。接种的叶片在Img/m1.DAB溶液（pH7.5）中浸泡。黑暗中室温下浸泡20小时后，将样品在含有乙醇和乳酚（2:1）的溶液中煮沸5分钟，并用50%乙醇漂洗两次。脱色后样品在甘油中保存以备观察。染色面枳02468IO12141618202224CK叶片毒素原液稀择倍数的悬液4.1.4.2 超氧阴离子检测将接种处理的花生叶片在真空中用Img/m1.的NBT（PH7.8）渗透20分钟,之后将叶片罚.于固定透明液溶液（三氯乙酸O.75g+无水乙静500m1.+延仿100mI）中固定脱色，待叶片的叶绿素完全褪去后，再用饱和水合氯酹透明，之后在甘油中保存以备观察。染色面积02468IO12141618202224CK毒素原液稀释倍数菌悬液4.1.5温度对花生叶片活性氧积JR的影响接种后叶片放在不同温度梯度内，测定细胞死亡率，叶片染色面积25C条件下，过氧化氮含量变化以及活性氧原位标记面积O2468IO12141618202224CK毒素原液稀释倍数5,CO2468IO12141618202224CK毒素原液稀粹倍数4.1.6光照对花生叶片活性氧积JR的影响接种后，叶片（细胞）放置于不同光照处理。连续光照02468IO12141618202224CK毒素原液稀释倍数2h光暗交替02468IO12141618202224CK毒素原液稀糅倍数黑暗处理02468IO12141618202224CK毒素原液稀释倍数4 .4p1.1.对花生叶片活性氧积累的影响耨接种后IOh的花生置.于日光灯下光照Ih,使其气孔开放，在接种后I1.h用注射装巴的小室扣住叶片，将确定浓度的清除剂与抑制剂注入注射装置的小室内(对照注射MES缓冲液)，形成一定的压力，使溶液通过气孔渗入叶片，在压力的作用下试剂向叶片两端扩展,待水渍完全消失后，继续黑暗保湿.5 .1.5活性氧清除剂(抗气化剂)对毒素的钝化作用供试药剂：过氧化公：CAT超氧阴离子：单线态氧：bixin(carotenoidcarboxy1.icacid),-carotene,DABCO(1,4-diazabicycooctane),-tocophero1.(vitaminE).reducedg1.utathione.1.-cystcinc.and(+)-SOdiUm1.-ascot>aic(vitaminC).Bixin,-carotene.and-tocophero1.weredisso1.vedin95%ethano1.andothersweredisso1.vedinwater(omakeas1.ockso1.ution.4.2结果与分析4.2.1 活性班原位标记4.2.2 淬灭剂对花生损伤和细胞凋亡的抑制作用2.3结论与讨论细胞凋亡机制根冠细胞：花生，烟草叶肉细胞：花生，烟草