无性真菌烟草尾孢质粒标记尾孢菌素缺失突变体.docx

无性真菌烟草尾泡质粒标记尾他菌素玦失突变体摘要：我们已经成功改编顺粒插入和限制图介导转化产生尾胞菌毒素缺失突变体块失突变体是从无性植物致衲直的Ccrcosporanicotianae.烟草屋抱得到的。转化程序上先前雄性化质粒或者限制性内切的的使用显著舜低了转化频率，但是促迸了一个更杂的不明确的版粒集合方式，这导坡CniCotiana。基囚组的突变.我体DXA通常能合到多拷贝上,当牌添加到转化混合物上时没有观察到单拷贝插入的增加.由于1873年转化于试险.恢良了39个推定的尾抱菌毒素(Ctb)突变体,这显示了足胞赭素产生的水平.7个Ctb突变体用预先畿性质粒不加酣快亚,这些被认为是无RE>f突变体，特异性插入和突变体表怨的相关性被确定,隔定方法是用野生.菌株救援质校作为基因敲除戏体.十五个当中的六个救援质粒检测产生是剂菌素缺失转化株,当重新加入到对生保I株时,给果显示在插入位点和尾胞前K缺失衣型中有联系.段片段他面攻击插入位点，这个插入位点从个插入突变体上饯攵的.这个片段的序列分析显示它是在带有与其他F1.曲的聚IW台邮的Ift旗H化前域高度同源的序列上限除的。这种聚IW合解施因的破坏使用救援筋粒，导致突变体在尾抱茵东产生上彳缺陷.因此,我们第次提供了分子证抠.证明了尾胞雨素介成是通过聚用化合物途径.前三讨论这个工作中,我们已经证明/使用质粒标记突变体形成的方法产生C.nico1.ianne突变体是可行的，这种突变体能够改变产生昆胞曲素的能力.通过短粒插入和限制性内切联介导转化法形成的突变体能够产生多史插入位点.在生物体的行性阶段，将非突变体1.株网接个假定的标记突变体通常被用去确定哪一个插入位点是可以改变表现型的功能的。在生物体中,例如Cnicotianae,它跳乏右性阶段,这个方法显然是行不通的.用救拨侦萩直接破坏如火他真函系统描述的那样，提供了一个可供选择的方法使质检插入位点和可改变的发现型有关联.然而.这种方法没有被广泛使用，或许是由相应集合体的低频率，正如我In也在C.nicotianae上观察到的.C.nicotianae上野牛.里基因的破坏的常造成低频率破坏.这个品示门司源整合对C.nicotianae是无利的事件.这个事件的罕见解界了为什么我W仅仅获得了低效车尾泡雨未产生突变体，是从6个救援短粒获得的，尽针我们转换15个救援质粒进入到野生里中.许多其他带中,带行线性质检和限出性内切油的梏座子能提面转化吸率.作为时比，在这个实验中用高的转化短率是功过C.nicotianae上带有环形,未经处理的质粒DXA转化而来的。这个实脸中顺检DNA彳T任何一种酹的线性化降低了转里子恢及的数衣.加果歆外的阱在转化期间加入.转化率则降低的更多.降低I而的增加成比例.这个发现表明,限制性内切防对CniCotianae原生成的生存能力或者是再生能力有有害作用，这个理傲在其他比曲中也被观察到了我们的结果与其他关于质粒的类型和构造、限制性内切胸的类里和数域,对REMI标记影响的楮网转化方式的实验相似.在RR1.1.中.限制性内切和绑定在线性化切粒IWA的末端,促进整合到基因组质粒中，通过非I可源的末战连接机制.然而，在我们的实验中,大部分的转化株包含多正软体攵制,不考虑转化混合中强体结构或者酸的存在。这个结果与其他曲形成对比.其他菌限制性内切够的添加增加了单密贝链合时期件的数fi.SoUthern杂交显示,至少我体的一个挎贝与我幽的基因组相结合这种结合通过兼容的结束来创造，创造通过各自的他。测序质粒PCtbI救援上侧击DNA片段，Pdb1.救报从突变体Ctb-1.CtbT足布茵素产生中完全缺乏.这个胶粒被限制性内切除消化.存在于PbiJrkS1克隆位点，一段0.8kb的XhO1.片段测序.这个序列变慢部分带彳聚阳合陆鸟同源的蛋白.预测的239个氨基酸用这个序列说明,C.ni8ti3部分聚!合基因（命名为CTBD,在区:上3卜35间可性和50-5八相似性需要限桂礼移的活性,在其他口端聚阴合僧上。有趣的是，用救援片段编码的限居林移的区域与TOX1.娟码的PKS没存相似性。数据显示C.nicotianae基因组包含一个CTB1.单一拷贝.