光调控花生疮痂病菌中痂囊腔菌素的代谢途径的转录组分析.docx

光调控花生疮痂病菌中痂囊腔菌素的代谢途径的转录组分析项目可行性研究报告一、项目提出的目的和意义(1)花生疮病病国内外研究花生(rachishypogaea)是我国主要的经济作物和油料作物，种植面积位列世界第二位，总产量居世界第一.我国花生种植面积较广，主要分布在山东、河南、河北、安徽、广东、江苏和辽宁等省区，据国家粮油信息中心提供的数据显示，2013年我国花生种植面积已达471万公顷。花生疮痂病(SPfuUrachidisBitaucourtetJenkinS)主要危害叶片和茎秆，形成大量疮痂状病斑(图I)。自1940年BitaUCoUn首次在南美的巴西发现之后，日本(根岸宽山等，1979)和阿根廷(GiordaeiH,1985)等国家也相继报道，并在各花生产区流行成灾。近年来，我国广东、广西、福建、山东和辽宁等主要花生产区相继发生危害，分布广，危害重，属典型的流行性病害.一般病田减产IO%3O%,严重田块损失可达50%以上。辽宁省2009年仅在甜芦岛花生产区零星发牛.，2011年的芦岛、阜新和锦州多个花生产区爆发式流行成灾，病田率75%100%病株率82.6%100%,病叶率42.5%95.3%,病情指数18.153.5,发生面积超过12万hm?(周如军等，2013),截止到2015年夏季已经传播到辽宁北部产区，且有维续殛延的趋势，已成为我国花生产业持续发展中亟待解决的植保问题，图1花生地猊病典型症状特征(左：叶片症状；右：茎杆症状)花生疮痴病(SPhaCMmaIirachidisBitaucourtetJenkins)属近年来新流行病害，国内外研究报道较少。日本学者根岸宽山在上世纪7O8O年代对日本该病病原学进行了研究，明确了病原菌为即6"cHow(根岸宽山等，1979)。巴西学#Keamey对病残体和种子在花生疮痴病传播过程中的作用进行了研究，明确田间病残体是该病初侵染源之一(KCanICyerR,2002),以曲丝体和分生的子盘在病残体上越冬，翌年产生分生他了，借助风雨传播。国外尚未见其他相关研究报道。目前国内研究主要集中在病原学、发生调查(方树民等，2007：李峰等，2012)侵染特性(郭陞秀等，2015)化学防治(田云云等，2014)等领域，申请人近年来在其病原学、流行因素分析、流行动态、抗性鉴定和田间防治等方面进行了系统研究并取得了相应结果(周如军等.2012,2014)。而国内外在病害致病因子、侵染机制、寄主与病菌互作等方面尚未见研究报道，研究博础较为薄弱，极大限制了该病宙的深入研究，无法为后期抗病育种和新型防控技术研究提供理论基础。(2)植物病原真菌毒素在致病过程中的作用机制植物病原真菌与植物在长期协同进化和复杂的互作过程中，逐渐形成有利于致病性的进化，产生多种对寄生植物有害的物痂统称为致病因子,致病因子的种类、含量及其活力决定其致病力强弱，进而影响病害的发生和严重程度.近年来，病原直菌致病因子及其机理研究已成为植物病理学的研究热点。研究表明，病原也的致病因子主要包括旅类、毒素、激素和蛋白类等多种物质|41,其中毒素是尾胞菌(CeZv。即入僚胞菌(Fusarium)、链格抱(AHernar小等多种重要植物病原真菌的致病因子.研究病原真菌毒素及其作用机理对于了解病菌致病机理、寄主与病原物的互作机制、抗病白种和寻找新的病杏防治途径具有重要意义。病原真菌毒素种类繁多，主要包括蛋白类，如小麦褐斑病菌(PyEphoratritici-repentis)产生的PTR毒素和棉花黄萎病菌("icidah1.iae)产生的VD毒素；WI昔类，如甘谶眼现病菌(HC/加Wr八"SaCCC力ai)产牛.的长蛤白糖;脂类，如甜菜尾胞病菌(ce；WW。M仪Ma)产生的W油三酯类毒素：杂环类(花假类、酚陵类、菲隈类等)以及第施酸衍生物等类群。其中龙鼠类毒素由于其具有光敏性可引起膜蛋白交联、膜脂过氧化、膜流动性改变、细胞骨架损伤、DNA损伤等作用而备受瞩目。花鼠类毒素主要包括交链抱毒素型、弗莱菌素型以及以金丝桃索为代表的其他类毒素。其中弗莱菌素型包括的尾抱第素和揄囊腔的毒素是葡版黑痘病、柑橘疮痂病、大豆灰斑病、玉米灰斑病等重要作物病宙的主要致病因子。前期研究表明尾饱菌毒素加囊腔菌毒素是病菌侵染寄主植物的重要毒力因子(1.iaOef«/,2(X)8)<.尾抱菌素(CerCOSPOrin)是由尾抱属真菌(Cev"W"<)产生的红色的毒索，首次在(Cen:o$PoraIdkUehii)中分离得到(Okubotvw/.1975)«痂囊腔菌素(E1.SinoChrOmC)是由痴囊腔菌(Esi泥)产生的红色或橘灯.色的蠡素，1957年Weiss等人首次在痂囊腔菌属真菌中发现，主要包括A,B、C和D四种衍生物(VeisseH,1964：1.ousbergetai.1969),尾泡菌素与痂囊腔菌素的生物合成还受到众多生理生化、物理因子的影响，其中光和氧气是两个必不可少的关键因素。CERSPORINCercosporaipp图3足用的素结构图2布囊腔曲素结构G）植物病原真菌毒素的生物合成途径目前研究的病原真菌毒素的生物合成途径大都有聚酗合前途径参与，甚至是直接相关，5 .可行性分析（1）实验材料的可行性：1.花生疮痂病菌所产生的痂囊腔菌素为光微性毒素，利用光照的调控，可以得到大量毒素产生的菌株以及毒素产生微量的菌株，省去寻找毒素合成基因并敲除基因的繁杂过程，直接通过转录组揭示，毒素合成的一系列基因以及与感受光相关的光受体基因。花生疮加病菌不同光照下培养性状图片毒素提取的图片2.花生疮痂病菌产也困难，光照培养下产抱量也明显受到（3）研究人员配置和知识结构可行性t项目组成员具有高级职称2人,中级职称1人，均为固定研究人员，主要从事植物病害流行学和宏观植物病理学教学和研究工作，另外配备5名研究生进行花牛.疮痴病专项研究工作，研究人员梯队和知识结构搭配合理，能够完成本项目的试验实施、数据分析、论文发表及课题总结等工作。6 .项目的特色与创新之处.（I）首次揭示花生疮痂病菌毒素为病菌的重要毒力因子，为花生疮痂病的致病机制的研究提供理论基础。（2）利用细胞悬浮培养技术从细胞膜和活性氧两个方向研究花生疮痂病菌毒素对寄主植物细胞的损伤及其诱导细胞程序性死亡过程，能锅更加准确地阐述其作用机制。（3）通过添加活性氧淬灭剂探究其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒害作用，不仅能够反向证明毒素是花生疮痴病菌的田要致病因子，而且研究结果能够为花生疮痴病的综合防治提供一个崭新的视角。2.8（期研究结果本项目以花生疮痴病菌为研究对纵，在前期研窕的基础上，以细胞悬浮体系为试眩平台，利用植物病理学和病生理学理论和研究方法，对花生疮痂病曲毒素的细胞毒性，胎侦过氧化、氧化胁迫和淬灭剂的作用及其机理进行系统研究，旨在明确花生疮痂病菌毒素在致病过程中的作用及其生理生化机制，研究结果对于揭示花生疮痂病菌的寄主-病菌比作和致病机制，抗病育种及新型防控药剂和技术的研发莫定了理论基础。（I）建立成熟的花生细胞悬浮体系,为花生病害的致病机制研究提供技术平台。（2）明确花生疮痂病菌毒素在致病过程中的作用及其细胞毒性：（3）明确花生疮摭病菌毒素细胞毒性的生理生化机制，为病菌的致病机制研究和抗病育种提供理论依据；（4）明确活性乳淬灭剂对细胞毒性和病情扩展动态的抑制作用机制，为花生疮痂病新型防控药剂和技术的研发奠定理论机制。（5）发表研究论文2-3篇，其中SC1.论文I篇，培养研究生2-3人四、研究基础与工作条件1 .工作基硼申请人近年来主持2项与花生疮痂病直接相关项目，辽宁省博士启动基金项目“花生疮痂病流行动态及其模拟模型的研究（20131106）”和辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目“花生疮痂病侵染机制及其流行成灾关键因子研究（2014056）”项目。在以上课题的资助卜.，开展了花生疮痂病病原学、分离扩繁技术、抗病性鉴定、流行动态和流行规律等研究工作，并发表多篇学术论文。对下本项目的研究内容，课题组进行,相应的前期研究工作.已完成供试三株和对照前株分离纯化及病原学研究工作：被止到2016年末课题组已完成辽宁省、江苏省、山东省等主要产区菌株收集工作，共获得菌株400株。并获得柑橘疮痂病菌和葡萄黑豆病菌2株对照菌株.花生疮痂病菌分离培养难度极大，旦菌落生长速度缓慢30大菌落直径约为Z1.cm）,前期研究掌握f病菌的分离培养及扩繁技术，建立了一套病菌稀择单曲落分离及研磨快速扩繁体系，并对不同菌株的培养性状和致病性进行了初步研究，发现不同菌株间存在生长速度、形态和产毒差异（如图5）：完成了已获得菌株的形态和分了鉴定工作，在对病菌分了特性研究的基础上撰写完成了Mo1.ecu1.arandPathogcnici1.yChanictcrizationofSphace1.omaarachidisIso1.atesfrom1.iaoningprovinceinChina论文（投稿）o图S花生疮痴病萧培养性状（左I病倒快速扩繁：中：病曲产毒能力；右：部分曲株培养性状篇选出不同抗感品种，明确接种条件：前期已完成了辽宁主要花生品种的抗病性鉴定工作，筛选出白沙1016为高感品种，对于病原前的生测提供了试验材料（周如军，2013,2014）,明确了花生疮痂病菌的接种条件，（周如军，2017）。花生疮疫病三毒索提取条件的初步建立：课题组在前期研究的基础上已经掌握从花生疮痂病菌中提取毒素的方法。将烘干的菌饼置于西酮中连续两次萃取I6h后合并，溶液经旋转蒸发挥去内丽后，将瓶壁用Im1.丙酮溶解得到花生痂囊腔菌毒素提取液，用薄层色谱法进行鉴定。建立了白沙1016的细胞悬浮体系：花生.细胞悬浮体系的建立是该项目顺利实施的保障之。课题组通过组织培养技术，以白沙1016为试材初步建立了细胞悬浮体系，（愈伤组织诱导：MS为基础培养基，添加ISmg1.的2.4-D、1.Omg，1.的KT+3.0mg1.的6-BA；悬浮培养：MS液体培养基为基础培养基，25mg1.24D+1.5mg1.KT+2.5g1.6-BA+30g1.蔗糖，培养20d）.冗ItW0.710.640.29图6花生疮梅病菌学素T1.C分析（左：荧光；右：H光）2 .工作条件（O课题坦拥有大量先进仪器设备.课题组所在的植物病害流行研究室依托辽宁省及农业部重点学科植物病理学科及辽宁省植物病害重点实验室，技术力量较强，设备条件先进，近年来伴随若沈阳农业大学的跨越式发展，在省、市和学校的大力支持下，投入大量经费进行先进设备仪器添置和更新换代，建立了学院和学科中心实验平台，结合学校开放科研平台，现拥有分子生物学、植物生理学、植物病理学、生物化学等相关学科完整、先进的实验设备和仪器平台，具有很好的研究平台。（2）课题组拥有较好的研究梯队.项目组成员具仃高级职称2人.中级职称1人,均为固定研究人员，主要从事植物病害流行学和宏观植物病理学教学和研究工作，另外配备5名研究生进行花生疮痴病专项研究工作，研究人员梯队和知识结构搭配合理，能够为本项目的顺利实施提供良好的人员保障。五、申请团队茴介周如军（项目申请人），男，汉族，1979年IO月生，博士，副教授，硕士生导师1.现工作了沈阳农业大学植物保护学院，主要从事植物病害流行学和植物真菌病害教学和研究工作。主讲“普通植物病理学''和"植物病宙流行及预测预报''等本科研究生课程，曾获沈阳农业大学优秀指导教师、青年骨干教师和十佳青年教学科研闵位能手等称号。2014年入选辽宁省农业领域者年科技创新人才培养计划。获辽宁省教学成果三等奖I项，全国多媒体课件大赛一等奖2项。申请人近年来的研究工作主耍围绕花生主要病害