人胰岛素的制备.docx

人胰岛素的制备I转化与扩缗*田工ii*a伐示意EE一、就得目的基因从供体细胞中提取mRNA,以其为模板，在反转聚醐的作用下，反转录合成胰岛索mRNA互补DN,再以CDNA第一链为模板，在反转录醐或DNA聚合醐I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。反转隶-聚合醐链反应法（一）从人体偏鹿内提取胰岛索基因转录的mRNA1,编度总RNA的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZO1.试将细胞裂开，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳C2,从总RNA中分期mRNA：取上述提取的总RNA若干，加入BufferOBB,O1.igotexSuspension,打匀。70'C水浴（裂解RNA的二级结构），20-30C条件下，静置（让OIigOtCX与mRNA结合）。将OIigoteX/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最终用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA.（二）mRNA转录合成CDNA第一悠ne第T的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-freewater,混匀后,70'C反应10分钟，反应完成后,马上将反应体系置于冰K5min;略微离心一"依次加入缓冲液、RNA能抑制剂、反转录施、dNTP（加入放射性同位素利于检脸），混勾，略微离心反应物之后,42'C放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。（三）PCR法扩增，带鼻合成目的CDNA健通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的CDNA链。PCR法的操作步骤：顼变性引物退火引物延长循环25-35次最终延长今前端引物:5,-ggttccggatctggttctggttctctggtcccccgcggtagtcaccaccaccaccaccaccgttttgtgaaccaacacctgtgcggc-3'今后端引物：5,-agtgtcgacttagttgcagtagttetccagctggta-3,二、也建重蛆质粒采纳pQE-30质粒作为载体，用双施切法进行基因重组。1 .双切法用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段,使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接前的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。2 .直组过程pQE-30用HindIn和BamH1.的切，琼脂糖凝胶电冰分别、回收纯化隧切片段。外源DNA片段同样也用HindII1.和BamHI懒切并回收纯化醉切片段。双前切后的载体外源DNA片段混合退火，因为HindIn和BamHI的黏性末端不匹配,避开了载体和外源DNA片段的自身连接,外源DNA片段只能定向地连接到载体的HindHI和BamHI位点之间。当然也不行避开发生载体的HindIn和BamH1.的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。三、构建基因工程（一）重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A健和B悠同时表达法将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苜的基因的卜游。重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分别纯化A-B能多肽，然后再依据两条处连接处的找基酸残基性质，采纳相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折存制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA的转化1,CaC12法制备大展杆受态编鹿：取100m1.菌体培育至OD600=05,离心收集菌体，用Iom1.冰冷的10mMCaC12溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1m1.冰冷的75mMCaC12溶液悬浮菌体，冰浴放置12-24小时，备用。2,大丽杆直.受态缰鹿的质粒转化：取100m1.感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组，DNA连接液，混匀。冰浴放置半小时。在42C保温2分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟。加入1m1.簇新培育基，于37tC培育1小时（扩增）。涂在合适的固体培育基平板上进行箭选C经典的CaC12转化方法：a将培育液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4C下3000g离心10分钟。b弃去上清,用预冷的0.05mo1.1.的CaC12溶液IomI轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4C下3000g离心10分钟。C弃去匕清,加入4m1.预冷含15%甘油的005mo1.1.的CaC12溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。d感受态细胞分装成2001.的小份，贮存于-70。e从-70C冰箱中取2001.感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后马上置冰上。f加入PBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过101.）,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。g42C水浴中热击90秒或37C水浴5分钟,热击后快速置于冰上冷却3-5分钟。h向管中加入ImI1.B液体培育基（不含AmP）,混匀后37C振荡培育1小时,使细菌复原正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因（AmPr）Oi将上述菌液摇匀后取1001.涂布于含AmP的筛选平板上,正面对上放置半小时,待曲液完全被培育基汲取后倒置培育皿,37'C培育16-24小时。（二）重组F的筛选和鉴定（载体遗传标记检测）1 .初第地随机挑取转化单菌落，在1.B/AK培育基（含100Pg/m1.氨羊青霉素和50ugmi卡那毒素）中进行培育，用O.5mmo1./1.1.PTG诱导表达。表达状况用16.5%SDS.PAGE进行分析。2 .倪首的后续矍定干电泳检温法将初筛选获得的重组曲扩大培育后，提取其质粒DNA,通过PCR对其进行扩增，利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大，用电泳法检测质粒是否为重组质粒。目的奢白表达检段所得菌体经溶菌悔/超声裂开细胞后得到的包涵体进行SDS-PAGE分析，所需基因工程前表达的外源蛋(HiS)6Arg-Arg-人胰岛索原以包涵体形式存在，其分子大小约为13kb,经电泳与胰岛素原marker对比，如条带显示有所需目的蛋白，则所得前既可做工程菌运用，经扩大培育后，斜面保存以便后续运用。3*.的保事15%甘油保存种，首液-20:80,充分混匀后70度保J1.h四、培育工程首优化发酵条件采纳比浊法测定不同时间培育基中菌盘，绘制基因工程菌的生长曲线，在摇瓶培养的水平下，采纳优化的发酵培育基发醉基因工菌，培育4小时候即进入对数生长期，而且对数生长期可延K至17小时。1,正交优化试龄：采纳正交法，选取摇粗培育条件中七个主要因素进行两水,F正交优化，该七个因素为：种子活化方式，摇床转速（通风量），IPTG诱导温度，接种吊，IPTG添加灵，诱导时间，补料方式。分别用A、B、C、D、ExF、G表示.以每升培育基收获湿菌体的被与发酵液的A600为目标豉，考察条件优化的效果，进行八次试验，对试验结果进行分析，优化出最佳试验条件。2,其他条件优化：在优化发酵条件的基础E,进一步就各种金属元素对苗体生长发重组蛋白诱导的纳响作了分析。3,放大培育（比较不同发除工艺产It）：在优化摇瓶水平发酵试脸的基础匕放大至11.培育基中比较两种发酵工艺。在不同转速，通气量，pH条件下，比较选择产量最高的发醉工艺。五、产物分别纯化由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品O基因工程药物的分别纯化般不应超过4-5个步豚，包括细胞裂开、固液分别、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以与成品加工。发酵液进行细胞分别，分别得到胞内产物和胞外产物。胞外产物干脆进行透析浓缩然后进行再复性与悔转化，再对产物进行高度纯化，最终制剂即可。胞内产物用溶醉菌或超声波将细胞裂开，细胞裂开后用高速岗心法进行固液分别。分别后用变性剂或者离子去污剂得到包含体，再用变性剂（尿素）使其变形，接着用二次复性法将其复性。对复性后的产物进行透析浓缩，然后进行再复性与醐转化，再对产物进行高度纯化，最终制剂即可。蛆量白分别纯化的特点重蛆蛋白质分别纯化的特点为：（1）大多数垂蛆蛋白质产品是生物活性物质，在分别纯化过程中，有机溶剂、溶液PH值、离千强度的改变均可使蛋白质变性失活a（2）重蛆蛋白质产品在物料中含量很低，取物料组成特别困难，例如，利用基因工襁菌发醉生产蛋白藤，物料中含有大量缀成困难的培育基、荣体生产代谢物等，疆拣蛋鑫囊魂含3器泰不瑟蛋鑫凄慈赞谓1%。春些舒拣疑囊矮存在予缀遂武或在胞内形成包含体，为获敬果白质，还需避行细脆裂开，结髯物料中含有大盘的细胞碎片和胞内产物。（3）含俄白质产品的物料不稳定，蛋白质产品易受料液中果自水解的降解。（4）许多惠组蛋白质产品作为医药、食品被人炎利用，因而要求蛋国税产器必绥是爽痰缝钳瓣，产蘸无萤、兹致热源等。与传统就生物大分子分别方式楣钺，繁缀蛋臼的分别纯纯恣熬秘用其携理稻化学性质的差异，即以分子的大小、形态、溶解度、等电点、祭疏水性以与与其它分子的亲和性等性质建立起来的。二次复性法:O.5g包涵体溶解于肯定量的缓冲液B(50mmo1./1.GIy-NaoH,8mo1.1.尿素，B弟基乙醇,pH9.5)中,使之充分混悬，静置1小时以上。混悬液分步逐滴加入到缓冲液C(50mmo1.1.G1.y-NaOH,半胱氮酸一胱锐酸，pH9.5)中，41静置复性过夜。上样于已用50mmo1.1.G1.y-NaOH(pH9.5)平衡的DEAE-SePharOSeFF柱，用O.ImO1./1.的氯化钠梯度洗脱，通过SDS-PAGE确定RRhPI位置，用DEAE-SepharoseFF做离子交换层析，收集含RRhPI的洗脱峰2,层析图谱见(图6).电泳检测显示(图11)峰2主要为RRhPI,与少量高分子杂质，收集峰2做再克性。峰1为PH高于9.5与些疏水性蛋白质形成的穿透峰，绝大部分PH低于RRhPI的蛋白质和核酸类杂质则坚固地结合在柱子上，在较高盐浓度与2mo1.1.NaC1.的条件下被洗脱下来，形成其他峰3和峰4。胰岛素原(RRhP1.)的再复性与酶切转化：1,复性将初步更性与纯化后的RRhPI通过透析浓缩，先后转换到缓冲液B和D(50mmo1.1.G1.y-NaOH,氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原型谷胱甘(GSH)pH9.5)中，使蛋白浓度为0.】O6mgm1.,4C静置过夜。2,切夏性后的RRhPI复性液调整PH后加入肯定量的胰蛋白福(Uypsin)和陵肽醐B(Carb。XyPePtidaSeB)在37。C进行协同般切一段时间，然后滴加2mo1.1.ZnCI:至ZnC1:浓度为0.ImO1./1.终止反应并沉淀生成的h1.,用双蒸水洗涤沉淀得较纯B9重组人胰岛素约79mg/1.培育基。重组胰岛素粗品的纯化：胰岛素粗品用。.2mo1./1.NaAcHAc,pH4.O溶解。溶解后的样品通过Superdex75进行纯化（图10）,得1、2、3峰，收集峰3,透析后冻干即为胰岛素产品所得胰岛素产品用SDS-PAGE分析为单带，电泳检测见图。图6.DEAE-SepharoseFF捧度洗脱层析图41U>9A.，*O14OD,三234S7£BHSDS班内掰St舷电冰检测闺1.低分子量标座；2.人映岛素标准后；3.人腹岛囊制品4.二次夏性法中通过DEAE-SepharoseFF纯化的RRhPI六、除首过流传统过