T_CRHA 052-2024 基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术.docx

ICS11.100CCSC(M团体T/CRHA0522024基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术Eva1.uationofdrug-inducedhepatotoxicitybasedonhuman1.iverorganoids2024-05-20实施2024-05-15发布目次前古II引吉IIII1范国12规范性引用文件13术语和定义I4端略语25一般规定26评价内容及流程57评价报告及结果解释10附录A（资料性）S药物的肝脏毒性评价实验方案12附录B（资料性）S药物的肝脏毒性评价报告16参考文献19本文件按照GB,T1.1-2020必标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则§给出的规则起草，请注意本文件的某些内容可能涉及专利“本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国研究型医院学会肝胆腆外科专业委员会提出.本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：清华大学附属北京清华长庚医院、中国食品药品检定研究院、中国计埴科学研究院、中国医学科学院药物研究所、中国科学院上海药物研究所、南方医科大学、上海美迪西生物医药股份有限公司。本文件主要起草人：王祖芳、柳娟、明雯球、李迪'耿娱超、王晶、傅博强、磔桂芬、潘国宇、彭双清、李桦、毕出嫦。药物不良反应是个匝要的匾床问题，也是卫生系统的主要经济负担和制的行业面临的巨大挑战，弱源性肝扭伤（dmginduced1.iverinjury,DIU）是临床上以常见的约物不良反应之一，也是当前急性肝损伤最为常见的病因之一，严重苕可导致急性肝衰避、甚至死亡.目前的临床前药物试验程序难以有效的值测患者是否发生DI1.I,评价模型和技术的缺乏是造成药物研发失败率高的主要原因.采用合理、有效的模型预测药物药物相互作用及漕在D1.1.1.是制药领域面临的严竣科学挑战。传统二维培养的肝细胞（系）模型过于简单、不具法牛理特性而无法再现药物体内发生的相对杂的代谢与掰性事件,而人源肝肚类器官作为药物代谢及药物毒性预测的模型，能够更真实地反映候选药物对人体的影响，同时可以减少动物研究所致的偏差.近期,美国优品药品监督管理局发布了减少药物临床试舱前的动物试验,而鼓励微组织与器富芯）；列为替代模型的指导原则，实际上，人源肝脏类器官模型已有许多公司和机构用于药物筛选及评价，但其发屣仍存在一些技术观莅障碍。本文件的制定有助于推动法于人源肝脏类渊也的药物肝脏安全性评价的标准化建设.助力行业规范发展.I1.1.基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术使用本文件的人员应有正果实SE做实Ii1.S本文件林指出所有可幡安全使用看者责任果通的安全和urn.并保国&合有关法械定的条件.本文件给出了基于人源肝脏类器官开展药物体外肝脏毒性评价的股规定、评价内容及流程、评价报告及结果鼾择要求。本文件适用干医药企业、科研机构等试脸人员开展基于人源肝脏类器官肝细胞脂肪变和胆汁淤积相关的药物肝脏揖性评价.本文件的试验方法适用于IJN1.板，其它孔数的多孔板可参考本文件。卷引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注口期的引用文件，仅该日期对应的版木适用于本文件；不注日期的引用文件，其展新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT16&!6.52017医疗器械生物学泮价第5部分：体外细胞毒性试验（ISO1（1993-5:2009）TCSCB00082021.原代人肝细胞3*三*½X下列术语和定义适用于本文件，3.1AJKSff1.t类*hun<anIiVerOMinTd通过多能干细胞、组织前体细胞或者成体细胞，依靠细胞自组装能力构建的三维细胞结构，它具备类似于人类肝脏的生理结构和功能,并能提供更准确和可维的体外实脸模型。注：人源肝脏类器官可被用于评估药物对人肝脏的毒性影响,可以更好地预测药物的代谢途径、药效和毒性反应。3.2药源性肝捐伤drgi1.ud1.iveriijun;D1.1.I由药物及其代谢物引起的肝细胞损伤和，'或坏死，进而导致肝懒升高、黄疸、肝功能衰竭等肝功能异常表现.3.3肝脏毒性评价Iwpatotoxidtve¼u1.uat>o<用来评怙某种物质或药物对肝脏功能的潜在危害程度的过程。这种评价可以通过多种方法进行，包括体外实验、动物模型和临床观察。3.4剂量反应关系dos。responsere1.ationship药物解第剂业与生物效应之间的关系，通常使用剂量反应曲线来描述.3.5对fiK18contro1.group在进行肝脏毒理学评价时,为便于与实5金组进行比较而设立的一组参照物质或实5金样本.它是一种不含受试物的介质，在进行受试物处理时放置于与试脂样品相同的器InI中,并在与试粉样品相同的条件下进行处理，3.6实3样本experimenta1.samp1.e在肝脏毒理学评价中用于进行分析、观察和5金证的被沏试物质或物体的代表性样品。3.7MMS*31.ventb1.ank为检i«实骁中可能产生的笄景噪苦或误差而设货的，不含待测物或对照品的介质，用以确保实蕤结果的准确性和可施性.来源：GBT16886.52017,3.3,有修改4语下列缩路谱适用于本文件.A1.B白蛋白(A1.bumin)A1.T谷内转我的(A1.aninetransaminase)AOP彳f害结局路径(AdVCrSCoutcomepathway)AST谷草转凝fi(ASPartatetransaminase)QFDA5-氯甲基荧光素皤酸图(S-ChIOtun?Ihy1.1.'Iuorcsccindiacetate)CYP$细胞色素iP450(CytochromcP450enzymesyscm)DMOS二甲基亚SM(Dimethy1.Su1.foxide)FBS胎牛血清(RHbovinesern)GSH谷胱甘肽(GIuta1.hione)HCS的内涵筛选(Highcontentscreening)MMI1线粒体膜电位(MiIoChOndria1.mCmbranCpotentia1.)P/S-竹毒素-钺有素(Penici1.Iin-StreiMomycin)ROS活性氧(Reactiveoxygenspecies)5-51三U试剂选择如下:a)细胞活力检测试剂应使用细胞活力检测试剂盒：b)生化指标检测试剂应使用谷内转氨制A1.IYGPT)试剂食和谷孽转找除AST/GOT)试剂盒：O生化指标检测试剂宜根据肝脏损伤的毒性结局类型，优先推存抽测细旭活率、细照揩亡、脂肪性病变和胆汁淤枳，1个肝毒性评价指标，主要检捌指标及对应检测试剂见下表】。衰1HCS试中此取册聊ttwm*Detect100indicator烫光探针F1.grcentprobe叱班长/发射波长Excitationwav1.m<th/三issiQWve1.ength细息活率Ca1.CeinANHthD-I495/515n11reen)495/635rm(red)加飒阳亡Ca5pase-37502/5M1111rocn)版海面貌与微蛆期面职的比值:指滴急荧光强设IjMj1.1.织向枳的比坐Ni1.eRed54358rm(red)形成的变川管面枳Vift组织Ifii税的比值：微粗管,均发光强度CMH)A492/517n11Cgrc<n)注»犯常选用几个终点组令以获得最准确的DI1.1.料，在同时检期多个肝近性评价指标时，安未保!愫测咕!ft.针对不PI的检测指标速用不同的荧光柒1，荧光柒后的激发波长和发射波长不41我,5.2材料和培养IMIa2.1AWKIMI1.raBM人源肝脏类器'讨的细胞应选用来源于肝细胞系（包括但不限于Huh7.HepG2-C3A.1.O2.HcpaRGh原代肝细胞、原代肝细胞衍生的肝细胞、干细胞分化来源的肝细胞等新型肝细胞体系，包括但不限干：胚胎干细胞或诱导多能T细胞分化来源的肝细胞：直接转分化肝细胞：一退分化形成的肝细胞Pm1.iHH.5.2.2 MWm待测药物的准备应按E人用药品注册技术要求国际的调会ICHV方协调指导原则3,其工作时的最高浓度设置应符合以卜要求：不受溶媒或培养液中的溶解度限制时，最高浓度是1mM或0.5ng1'm1.（选择其中较低者）；受到溶解废限制时，最高浓度应采用培养液中产生最少可见沉淀的最低浓度（若其不干扰评分）。通过肉眼或光镜检杳等方法对沉淀进行评价，来说明在培养过程中沉淀持续存在或出现（至给药结束）。5.2.3 iMMSM应选取适当配方的、含有必需泮养物和辅助因子的细胞培养呼，用,支持人源肝脏类器官的生长和维持,包括：0.05%胰蛋白酹-EDTA用于人源肝脏类器官的择放和分离，磷酸缓冲液（PBS）用于洗涤和处理人源肝脏类落官样本，蒸饰水（或任何适合细胞培养的纯化水）用于制备培养基、溶液和洗涤人源肝脏类器官.5.2.4 培养!应选用适用细胞培养的器皿，包括但不限T：玻璃培养皿地料培养瓶或塑料多孔培泳板微限滴定板96孔i1.的细胞培养线孔板,注：只要符合组织培养的要求,并可以用于动物细胞的培养,其他孔板（如384孔板、24孔板和6孔板）也可以昔代使用。5.3仪。5.&1ttffM稳定的温度（37七）、稳定的CO2水平（5%）、较高的相对饱和湿度95%）.6.3.2多功能标仪适用丁96孔板培养器皿、波长范困：400To（X）nm、带有发光检测模块。6.3.3高内聊皿分析加ft或荧光而内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜应符合以卜里求：一高内涵细胞定量成像分析系统,包括全自动高速显微成像、全自动图像分析和数据管理.一荧光显微镜，包括光源、源板系统和光学系统。一系统和显微情的激发波长范围为355-675nm,发射波长范围为430-760nm.5.3.4应符合以下要求：一加速度大于等于2000ref;离心力1.OOOro.000ref.1.1.1 工作台或生物安全柜应提供高效的环境净化,包括无菌空气过泄、消毒和防护机制.以确保细胞培养过程中的无菌操作和确保细胞及操作者的生物安全。5.3.6 MU三1IWM应具有高分辨率和高清晰度（10倍、20倍、40倍或60倍物情），能纺显示微小组织结构和细胞:配备有高质肚物镜和目祗5.3.7 实险取平应使用电子式天平量程为0.1mg-2&分度值不大于Ing5.3.8 电子例触修皿Ia出M1.应能够快速、精准地W数细胞数t并其名高度更且性和准确性。5.4准备工作5.4.1 评价方案准备开展药物肝脏毒性评价前应制定评价实验方案，方案内容及格式参见附录A.5.4.2 海成用砌帆.5.4.2.1 CTC试剂盒应按以下制制Hh1）将试剂盒放置在4'C过夜，使试剂缓慢解冻；2）在使用前将试剂置F22C水浴中约30min,将其温度平衡至室温；3）颠倒内容物轻轻混匀，以获汨均侦溶液，5.4.2.2 A1.T*ASTIWW应按以下步准备；D使用前将试剂设于37C水浴中预热约30min;2）顺倒内容物轻轻混匀,以获得均质溶液。5.4.3 CaktinAMZEtIM1.试剂应按以下步准备:1）-20'C潮光保存