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ICS11.040.30CCSC30T/CSBM体标准TCSBM0050.42024创面修复材料有效性评价第4部分：体外微血管形成试验评价方法Effectivenesseva1.uationofwoundrepairmateria1.sPart3:1.nvitromicroangiogenesiseva1.uationmethod2024-05-14发布2BHM)1找中国生物材料学会发布早期的创面愈合材料为淬通无菌的敷料,主要起到物理隔齿保护创面的作用.的若生物材料的不断发展，具有组织再生能力的材料不断出现，这叫材料不仅具有保护创面，而H.具有促诳创面细胞再生迁移，加速创面愈合速度和提高创面愈合痂扇的作用，I1.前评价创面材料的有效性主要是评价对细菌的隔离作用，尚无从细胞水产评价材料促进创ifd愈合的方法.本文件栗用体外细胞培养的方法，评价材料对做血管形成的影响,评价材料促进创面愈合的有效性.开放伤口愈合过程中伤口收锦占主要地位，-殷可达8<%其余为上皮细胞新生、胶原蛋白合成及肉芽力博渊殖.其中新生肉芽:如织中血管的形成对创面的愈合质量影响较大，丰富的血管具有明显提府创面愈合质信的作用，反之不利于创而愈合。生物材料促进创面愈合不仅具有促迸愈合速度，在定程度上还具有促进创面微血管形成，也具有提高愈合版Ia的作用.本文件栗用体外细制培养技术评价创面修复再生材料的微血管形成作用.创面修复材料有效性评价第4部分：体外微血管形成试验评价方法1血本文件规定了创面修复材料体外评价的样品制备、血管形成试验和结果分析.本文件适用于适用于创面修”材料促进创面微血管形成效果的评价，2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件.仅该H期对应的版本适用于本文件：不注FI期的引用文件，其最新版本（包拈所有的修改单）适用于本文件。GB.T16886.12-2023医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品T/CSBM0050.1-202-1创面修Si材料有效性评价第1部分：水溶性材料体外评价方法T/CSBM0050.2-2024创面修史材料有效性评价第2部分：水不溶性材料体外浸提液评价方法3 *ww½xVCSBM0050.1-2024界定的术语和定义适用于本文件。3.1血管形成angiogenesis血管内皮增生、延伸而形成新血管的过程,44.1 水潮t材料水溶性材料采用的浓度按照T/CS8M0050.1-2024中第4章规定的方法确定。4.2 水不溶性材料浸提液制备按照1.CSBMoO50.22024中第4章规定的方法制备.5血蜴械试5.1 ra人的血管系统负货将营养物质和氧气运送到几乎所有的器官和组织，并将产生的凄物通过循环排除体外,血管生成在组织损伤修更中具有很大的作用，血管的缺损会延缓伤口的愈合甚至造成伤口长期不意.血管新生有利于拈膜损伤后的修复，因此通过EU1.Y926细胞探究水凝胶浸提液对于A1.管形成的影响.5.2 M、WFHD*hAMX5.2.1 M读哈器具如下：a）二氧化碳细胞培养箱；b）恒温水浴摇床：C）高压蒸汽灭曲锅：d）倒置荧光显微镜；e）细胞计数仪:D恒温水浴摇床：g）陆标仪：h）电子天平：i）液级施：j）冷冻离心机；k）T25细胞培养瓶：1）24孔板:n»）基侦股：n）1mageJ图像处理软件.5.2.2 试剂和耗材读监试剂和耗材如下a）MEM低糖培养基：含10%胎牛血清:b）磷酸缓冲液（PBS）;00.25%胰蛋白而。5.2.3 AMME3Y926m跑.5.3 格MH1.5.3.1 试样品按照4.1、4.2制备，5.3.2 空白对NIMEM低期培养基，37t、120m面摇床中点荡21h,5.4 MVhMR5.4.1 E.HY926UMHI1.1.1.1.1 4.1.1M震苏将EA.HY926细胞冻存管于37C恒温水浴锅内不断晃动，特细胞冻存液完全溶解，将冻存的细胞悬液转移至15m1.离心管内，随后加入MEM低糖培养基，用无菌巴氏吸管吹打均匀后100onnin惠心3min.弃去上清液，用MEM低糖培养基或悬细胞，随后将细胞转移至T25的培养瓶中,在3735CO2细胞培养箱中培养，24h后观察细胞状态，并给细胞换液。1.1.1.2 A1.ftftR当细胞密度约为WA时，吸去培养粒中原有的培养基，使用PBS料洗两次，加入Im1.2n1.025%胰蛋白酚消化3min5min,显微镜观察细胞消化情况，当细胞边缘缩小，贴壁松动时，手指轻叩细胞瓶身，肉眼可Mff1.胞脱落，向培养瓶内加入一定St的MHM低糖培养基终止消化，MEMM雄培养基与Q脑腕蛋白酹的比例为5:1.终止消化后，用移液怆轻轻吹打细胞层吹打时宜尽量做少气泡的产生,将细胞层吹落、吹散，然后将细胞般液特移至离心管内，100O加而离心3Hn.弃去原有培养培，加入3m1.、5m1.>1EM低糖培养JB将细胞重新混姓，取适状混匀的细胞怂液于细胞培养精内，在37C、於CO2细胞培养箱中继续培养.传代比例为1:4,2天一3天传代。1.1.1.3 细胞冻存细胞消化后，K）OOnhin离心3mia加入冻存液将细胞混匀，J«10U闻胞悬液用细胞计数仪计数，然后将混匀的细胞悬液放入冻存管中，得管Im1.冻存密度为IX1.o1.,m1.7x1.（Vm1.冻存管上应标明冻存细胞的名称、密度、代数以及冻存人和冻存时间.冻存细的先4C放置10mm,再20P放置30min,然后-80C过夜，梯度降温后将细胞转移至液氮中保存.5.4.2小成试小管形成试验步骤如下：a）将基脑胶放入冰箱4C过夜缓慢融化。怆头、24孔板等放入冰筒-20C预冷：b）将基质胶以每孔20。P1.缓慢加入预冷的24孔板中，避免气泡产生，注意操作过程中手持EP管上方,手心不应接触EP:c）将铺有基质胶的24孔板放入冰箱IX?外置15min,然后转移至37七培养箱中外置30min,使其凝愠：d）待细胞融合至80%左石时将细胞消化、离心并分别用试脸液和空白财照液重悬细胞,随后细胞以IXIoVm1.加入24孔板中，M1.1.m1.,3个及孔。放入恒温细胞培养箱中维埃培养，分别在3h、6h、9h观察小管形成情况：C）将细胞按照d）步骤铺板，在:6h时将细胞固定免疫荧光染色,显微僮下观察小管形成情况，并拍照，【mageJ计亢成管数量，观察浸提液对血管形成的影响.6结果分析6.1 附录A给出了体外微弱管形成试验方法的实例.6.2 小管形成试验结果：在观察时间内血管形成情况的描述，并给出显微镜下图片结果。6.3 免疫荧光染色结果：评价由管网形成的数玳和血管形成的总长度，采用统计学评价方法，评价材料促进血管形成的效果，并给出免疫荧光染色的结果图片。经统计学分析试险组和空白时照组比较fX005则认为该材料具有促进血管生成的作用,否则材料没有促进血管生成的作用.附量A体外Ik1.Egtm«例A.1Mx试旗联材、细胞系6.X1M试验器具如卜7a）二氧化碳细胞培养箱：b）恒温水浴插床；C）高压蒸汽灭菌糊：d）倒置荧光显微镜：e）细胞计数仪；f）恒温水浴摇床：g）酹标仪:h）电子天平：i）液短就：j）冷冻离心机：k）T25细胞养瓶：D24孔板;m）基质股；n）ImageJ图像处理软件。6.3.2试剂M材试验试剂和耗材如下:a）MIiM低融培养基：含10%胎牛血清：b）无血清培养基；c）磷酸缓冲液（PBS）;d）0.25%腴蛋白利。6.3.3缰胸系EA.1IY926细胞.外阳.自带细胞STR鉴定报告.A.2品A.2.1MAtK以消化道创面保护胶为试样,在无i陶状态下,按以下条件制备浸提液：a）浸提温度：37C±1;b）一提时间:24h±2h;c）浸提介质：无血清培养基：d）没提条件：120Ivmin授床中段藩：e）样品和浸提介质的比例：按照GB"16886.122023中表1的规定进行.A.2.2空白对IeMEM低楣培养基,37,120r/min摇床中震荡24h±2h.A.3MMMA1EA.HY926iM(M#按5.4.1进行。A-3.2小成试It按5.4.2进行.A.4Ji1.彩成试果A.4.1小各组细胞分别加入处理后的样品重悬.随后接种到铺板基质股的24孔板中培养9h.观察各组血管结构在不同时间的的生成情况,细胞刚接种时大多呈圆形，随着培养时间的砥长.细胞开始长舟伪足.与相邻细胞相连：3h时.部分细胞由Ia膨伸展为长极M部分细胞间逐渐建立连接：6h时,细胞多数于周闱细胞建立连接.线样结构增多且细胞逐渐形成管状N格结构：防首时间的延长,形成的线样结构逐渐断裂，细胞逐渐城集，小管样结构数量减少。XK)O显微镜下不同时向小管形成情况见图A.1.阳6h9h说明：A空白对氯组培养3h;B¾臼对!幽附猴忙C空白对然照养9h.a雌缈傣Itb试验组培粼kcW三1.9h.KA.1X1.OOM-不同时何小也成情况A.4.2免疫袋光染色结果管状形成反映了人脐修脓内皮细胞的体外小管形成能力，样品浸提液与对照组相比，血管形成数目和小管总长度均有统计学差异(P<000).免发荧光结果可以发现,对照组细宽为长梭形，但细胞之间未建立紧密连接.样品如细照之间砥束相连.形成小管状。综上，水凝胶能够促进血辟形成，且形成的血管网状结构也更加成熟.免疫荧光染色注果见图A.2.0)SA.2免知眈染色结果A.5绐论样从能忏效促进低值管形成,且在6h时小管形成效果报佳,血管数量增加,