GB_T 43650-2024 野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程.docx

ICS65.020.01CCSB6(1OB中华人民共和家标准GB/T436502024野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程Technica1.proceduresforDNAspeciesidentificationofwi1.danima1.sandtheirpr<iucts202D7-01实施2024-03-15发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会前三inI范阳12规范性引用文件13术语、定义和缩略语I3.1 术语和定义I3.2 缩略语24样品采集与饰存21.1 样品牍21.2 抽样21.3 取样与储存21.4 运输35 D、A整定的构成46 DNA程定程序46.1 样品前处理46.2 DNA提取563DNA纯化56.4 DNA质量评估56.5 检费方法67站果表述IO8追溯方法IO9污染预防与处理10IO实验室区域设置10H仪器和试剂要求IO12实舱室清洁1013安全防护1014废弃物处理10附录A（资料性）电泳检测程序I1.A.1常规电泳检潴法11A.2芯片电泳检测法12A.3其他电泳检测法12附录B（费料性）通用引物序外信息138.1 Cytb基因通川引物138.2 CO1.基因械引物13B3I2SrRNA基因通用引物13B.416SrRNA基因通用引物13附录C(资料性)通用引物PCR反应体系与反应程序15C.1反应体系15C.2反应程序15附录D(资料性)特异性PCR的引物、反应程序与反应体系16C.1高鼻羚羊(Saigatatarica)特异引物16C.2雪豹(PamhCraUnCia)特异引物16C.3豹(Pan1.heraardus)特异引勃17C.4虎(PanthCratigris)特异引物17C.5黑黑(UrSUSUIibetanUS)特异引物17附录E(资料性)qPCR反应体系与反应程序18E1.反应体系18E.2反应程序18附录F(资料性)dPCR反应体系与反应程序19F.1反应体系19F.2反应程序19参考文觥20本文件按照GBJT1.1-2020标准化工作导则第1部分，标准化文件的结构和起草姆则？的埋定起草,请注意本文件的某些内容可能涉及G利，本文件的发布机构不承担识别专利的货任.本文件由国家林业和草原同梃出.本文件I1.1.全国野牛.动物保护管理。经普利用标准化技术委员会（SAGTC369>H311.本文件起草明位:东北林业大学、东北林业大学1泣矍定所、深圳华太生命科学研究院'中国海关科学技术研究中心'雁龙江省公安厅哈尔送检抬检测认证集团有以公”:、深圳华大法医科技有限公司'广东华人法医物证司法鉴定所、昱龙江省野生动物研究所、华南动物沏种环I指害司法要定中心、南宁海关技术中心、南京瞽察学院、介班海关技术中心、广西壮族自治区公安厅、东西市公安局.本文件主要起草人.白素英.马跃、1：.鹿、李波,张伟、孙怒、徐范作.张利峰、王划刘微.杨天天、竺天明、U1.野生动物及其制品DNA物种饕定技术规程1»9本文件规定了对野生动物及其制品的米源进行I）、A物种鉴定时样品采集与储存、DNA鉴定程序的构成、DNA鉴定程结果我述、追溯方法、污染预防与处理、实验，区域改置等主要技术要求本文件适用于野生动物及其制品来就物种的DNA检验鉴定2般范性引用文件下列文件的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的余款，其中，注日期的引用文件，仅该n期对应的版本适用r本文件:不组口削的引文件.其以新版本（包括所有的修收单）适用于本文件.GB191s9实验室生物安个要GBTW95.2传基因品险实验术要求GbHS的图柒麻城*核破噌度和慰百则紫光光度法GA.T383法庭科学DAA文蛤空检验规I-YT2501野生动物及品的防中鉴定规范NY/T51-216兽医港期样品采集保存导啥技术观负3术咏定义和语3.1 术语和定义下列术语和定义适用J本文件3.1.1DNA条形码DNAbarCOde选定的标准区域的、用于物种鉴定的段和对较短的保守DNA片段。3.1.2DNAMHt定DNASPVdCSidvnti11catiun利用DNA检聆技术时野生动物及其制品进行分类地位（科、M、种）的判定.3.13序列H1.对a1.ignment利用计算机算法和程序，确定两个或多个核甘酸序列的相似性以至于同源性.3.1.4引物prers人工合成的两段互补募核甘酸片段,一段与靶区域5'蛤DNA模板链互补；另段与靶区域3洪DNA模板鞋互补.3.15黄IMi'f1.uorvswtPmbe5'端和3'端分别标记荧光基团和淬灭基团，井与日的DNA序列碱基互补的一段DNA片段，3.2 1诺下列缩略语适用于本文件.BO1.D:生命条形码数据系统(baru(x1.eof1.ifedataSyS1.em)C(ft：循环阈值(CyCIethresho1.d,或Cq值)Cytb:细胞色素Mcytochmmcb)dPCR:数字PCR(digita1.PCR)PCR:聚合配锥式反应(Po1.ymCraSCchainreaction)qPCR:实时荧光定GPeR(rea1.-1.imef1.uorescenceqwntitativePCR)KHP限制性片段长度多态性(restrictionfrawnt1.engthPOIyIrQrPhis1.i)44.1 w&xa41.1.样品分成两等份，作为检样和储存样.41.2领鸵标记编号，记录采集时间、地电'会等内容，保证样品可追溯,41.3样品分别果集、分别包装，注意工具清砌肖毒，防止交叉污染。4.2 邮421形态特征完整、可分类识别的同类多个检材，按照GB.31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行，422具有部分形态特征、可简单分类的多个检材，先分类，再按照GBZ31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行：或按照GBZZ31233中的分层抽样规定执行.423不具有可识别的形态特征的大批量检材,先按照GB231233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行结果出现多个物种时,再按照GBZ31233中的分层抽样规定执行.物种的个体数址可按鉴定结果所占比例核算。4.3 取的僧存昆虫等小型无脊椎动物可整体取样，取适嵌或整体粉碎,收集到需心管或密封袋等储存介成中，T燥常温、冷窿或-20'C保存.43.2 tam三应先去除易污染的表层,宜采取新鲜洁净的组织或内脏5I1UiP以上,收集到离心管或密封袋等储存介质中,冷藏渺存，宜尽快在一20C以下保存.43.3 蝴取】Cm=以上收集到疡心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏或-20C保存,404*3F整体送检或清洗后取不少于02g舒豹或牙粉I织残的时宜取组织）,收集到离心管或密封袋等储存介顺中，干燥常温、冷畿或-20T保存。4.3.5皮肤雌物4361角、，爪、麟鲫«整体送检或清洗后取不少于02g检末等收集到离心管或密封袋等储存介防中,干燥常温、冷藏或-20C保存。41&2、M收集1根以上置于国心管或密封袋等储存介质中,干燥常淑.冷藏或20C保存.也1.蜘生般指由½Bi而由愉珠甜野匕羽,%瓜豚角、M.然盾片、骨板、龟甲等.416IwS（M）宜选新鲜全血采佻于EmA抗凝管或果血卡.血痕宜用采样拭子等采集,抗凝管和采样拭子等冷藏或-20'C保存；采血K瞭干，常遍、冷罐或-20C保存。4X7飒用湎洁容器或密封袋等收集1m1.5m1.,花封,冷藏或-20匕保存.43.8M用消毒的镣子或勺等取整颗或在表层和内层各取不低于0.2g,收集到窗心管或密封袋等催存介质中，可加干燥剂或保存液，常海、冷或-20T保存.4 09唾液等用消毒的纱布、棉花或拭f等采集,睨干密封常淑保存：或者直接密封,冷藏或201C保存：收集足球其他分泌物到离心管或密封袋等催存介质中，冷藏保存，直尽快于-20C保存。注；分泌物是指由腺体器官分泌的物质。4.45»4.4.1 样品宜尽快送检。干燥样品常温运输，鲜软组织等易腐败的样品应冷藏（特殊时干冰冷冻）运愉.4.4.2 每个样品应分别包装，在样本袋或容器外标记清楚，再将各样品放到统一包装袋或盒中.443抗凝管室½J容器，放入盒内，加续冲材料固定，防止晃动,破裂.444包装应防水、防漏、密封良好。4.4.5 疑似疫先（如禽流感等）动物样品，应先消寄处理后，包装按照NY/T5412016中7.2的炊定执行.5 DN基定程序的构虞DNA格定程序包括5个操作步骤，依材无形态号别特征时，有4大类方法可选：检材具有部分形态探别特征或理化膝别指标等时，可与之结合进行淙合判断，程序流程图如图1所示.I1.)N*X*1.*MB6i)NA*j(W9c1.WAttASG1.1.皆、A*用75%乙醉或去离子水等清洗衣面2次3次，粉碎(必要时脱钙)处理.&1.2蝴、KKV新鲜皮张等去除表层,剪碎或研脚.干爆皮张等应先用7取乙醉或去肉子水等清洗2次3次.援冲液浸泡去除表层，再剪碎或研磨.6.1.3SM4R81R新鲜干净纲织包接剪碎或研磨，干燥组织应先用缓冲液浸泡、去除表层,再剪碑或研磨,&1.4,W用7洲乙醉、去离子水等充分清洗、剪碎。6.2DNAH®&21amm依据检材类型和IAA物种3定目标，确定INA提取方法，应设置空向财照并严防交叉污桀.适用于组织、血液等样品M充足的检材,按照GAT383的相关规定执行.适用于组织、血液等样品量充足,且需要大片段DNA进行全基因组测序的检材.&24KMffi0itt适用于组织、血液等样品量充足的检材，毛、羽等做盘检材以及找便等拉材，应严格按照说明书操作.6.2.5适用于毛、羽等微破检材以及粪便等检材,应严格按照说明书操作.&26全自动工作站法适用于大批及样品，应严格按照仪器说明H操作.&2.7期岫UR方法使用等效DNA提取试剂食.或验证的新方法.63DNA惋化UJ选择商质琏纯化试剂盒或同行验证的纯化方法。6.4DNMW6.4.1 MtiftatA按照GB打34796方法,测定DNA浓度,并判定闪纯度.&42评估DNA片段大小,判断DNA完卷性（见附录A）.6.43qPCR法检测样品口标范因的C1.侑，分析DW含量.&44K三½检测与DNA结合荧光染料的荧光强度，定11小DNA的浓度.&565.1PCR法&&1.1通用弓|蝴8序法&&1.1.1应严格设词阴性时照（不加DNA的空白对照）与阳性对照（已知物种的DNA样品，必要时），&a1.1.2确定门标区域（如DNA条形码、Cy1.b基因等），选择通用引物（见附录Bb按照反应体系和反应程序（见附录C）进行PCR犷剂,电泳检测见附录A.有扩增产物且与预期大小一致，则纯化（按纯化试剂念操作）或直接测序（混合样品克隆测序）.如无扩增产物.分析原因重新试验.&&1.1.3fmfr使用B1.AST或C1.USTA1.笄软件,将测序所得有效DNA序列与候选初种的标准序列进行序列比对，得到序列