醇型和酮型广藿香DNA甲基化的MSAP分析.docx

H的使用MSAP技术对2种化学型广常香Pogostcmoncab1.in的必因组DNA进行甲基化分析。方法使用甲基化敏感扩增多态性（Ineihy1.ationsensitiveamp1.ificationpo1.ymorphisin.MSAP）技术检测2种化学型、共计197个广笊香样本的DNA甲基化程度。结果4类MSAP位点信息的Shannon多态性指数的最高值或较高值均在阳春、德庆、高州大胴、禄步、广宁5个产地中产生:石牌广猿香（削型）与其余产地的广猿香（酹型）形成2个分支：广菰香居群间的变异所占百分比远大于居群内变异所占百分比，达60.66%：共筛选出IO条石牌产地与其余产地的差异性片段并进行测序分析，其中一条属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。结论可通过MSAP技术在不同来源的样品中鉴别出石牌产地的广箱香：广蜜香不同化学型的形成与其DNA甲基化水平有着密切的联系，尚需更进一步的研究。广求齐PogostcinoncabIin（BIanco）Bcnth.属唇形科刺浅草属草本或半灌木，具芳香化浊、发表解暑等功效,主治湿浊中阳、脱落呕吐等症目前根据主要化学成分含量的差异，可将广菰香分为2种化学型：广茄香酥型（广州、颦庆市裔要区产“牌香类”）和广笊香雨里（广东港江地区吴川、遂溪、雷州产“琼香类“）2。由于广指杏的核甘酸序列并未发生.变化，因此化学型的差异属于表观遗传变异的范畸。DNA的甲基化是种重要的表观遗传修饰，与基因表达、基因组防御、细胞分化,染色质失活和基因组印记的调节有关.近年研究发现，植物在发育和分化过程中通过改变甲基化的状态来调节基因的表达3,DNA甲基化水平在不同植物中都与其生长阶段存在着密切的联系4-5aMSAP技术是研究DNA甲基化的有效技术。核技术能够检测全基因组范围内5'-CCGG位点的甲基化模式，分析不同居群的中基化位点信息，还可针时特异性片段进行切胶测序，以明确与表观遗传变异相关的基因，适合于本研究中对于不同化学型广潴杏的分析。目前有关广循香的研尢包括百秋李静的代谢途径67）及使用分子生物学技术|8-9对不同种群的广布杳进行研究，但尚未发现有学者对不同化学型的广布香进行分子生物学研究MSAP技术被广泛应用下研究不同居群、不同品种植物的DNA甲基化模式及多态性等。1.i等”0的研究发现，MSAP标记技术可以有效地检测野生大麦种群内和种群之间的DNA甲基化模式：在OCana等11的研究中，23个程定的MSAP条带能够区分92.5%的前笥克隆个体：李宇等12使用MSAP技术分析不I对辣椒品种果实发育过程中的DNA甲基化时，发现辣椒DNA甲基化的位点既存在于DNA的编码区，也存在于非编码区。以上这些研究都说明MSAP技术是分析种群结构、探究物种之间变异的有效工具。本实验以不同化学型广蕾香为材料，使用MSAP技术对广/香基因组的甲展化情况进行研究，并利用得到的分子标记数据对不同化学型广莱香的遗传结构、遗传分化程度、遗传距离和遗传多样性等内容进行分析探讨，初步探索不同化学型广流香的分子生物学上的区别。I材料与仪器1.1 材料样品为采自10个不同居群的广指香种质，共计197份，经东药科大学教授鉴定为广汇:香PcgostenioncabIin（B1.anco）Benih.,样品信息来源如表1所示。从每侏广就香上采集20片生长良好、无病虫害的叶片，硅胶干燥并放入-20C冰箱中保存备用。i3FmrrrttIM1Samp1.eM35tofFCaMnfrom<ffOrgQI必号年厦经厦««BS1.-X南门”2以，江友均队19JTN2016-11SX1-204USHit!UMM2I21Nnoor三加“12GZMS广东茂名市昌州6,JHHIIOWE刈M1.YC1.N弟江市用6痔京氏乡U22034IusrB201611DQb23tIJT1.UR里“8212TN11123三刈0111.1120广豪佚a11X曜午“H22WN1114E刈&】11.SIN金庆届K抬aI.分M2229SH24S*t加Ig1.CN1.RWITM<f三Hit1.H233C11?TrEXHG1.1.SHIY厂拳伍K会M埼口KNIH23504IIJTtT指心I1.SPI1.SWHmJ-HKUtItK2J21N113JrE2017-011.2 试剂3种限制性内切拗Hpa1.KIoU训.）、MSP1.（20U1.）ECORK20U1.）TaqDNA聚合旅（5U1.）.ATP（0.01.mo1.1.）,NEBbuffcr4均购自NEB（）有限公司：BSA（20mg,i1.）购自生物技术有限公司；植物DNA提取试剂盒、MarkCr购自公司：胸切产物纯化试剂盒购自Q1.AGEN公司：普通用物、接头序列由基因公司合成;带荧光修饰的引物由公司合成、DTT试剂、PCRIUbes、1.5m1.离心管购自Axygcn有限公司1.3 仪滞D1.-600C型电泳仪（生物科技有限公司）：BG-SubM1.D1.型水平电泳槽（生物技术有限公司）:RCan-4100型全自动凝胶成像系统（生物科技有限公司）；K55OOP1.us型超微量分光光度计（科技发展有限公司）；3KI5型台式高速冷冻离心机（美国Sigma公司）：MJ-54A型液压蒸汽灭菌锅（美国施都凯仪器设备有限公司）：373OX1.型毛细管电泳分析仪（AppIiedBiosystems公司）。2方法2.1 毛细管凝胶电泳使用庄盟植物DNA提取试剂盒提取DNA,通过0.8%琼脂糖凝胶电泳和超微星紫外分光光度计检测所提取DNA的痂量、浓度与纯度。提取之后，稀释至20ng1.,-20'C保存.根据Gucvara等"3J的方法进行朝切、连接和PCR扩增。将选择性扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测，可得到经2组的切、扩增后，包含广指乔样品的基因组DNA的MSAP位点信息的氐！文件以及荧光检测图。经同组酶切、选择性扩增后，石牌产地含有而其他产地不含有的MSAP片段作为差异片段进行测序分析。其中，使用的接头及引物的序列如表2所示.«2广雷香MSAP分析引物筛选使用的引物和接头序列Tab1.e2SequenceofPrimerSandadaptorsusedinse1.ectionofMSAPana1.ysisPrimerSofP.cab1.inEc,oRI-adapt01（接头）EcoRI-adap½r2（接头）mHAp1.-adatcr11接头）您血峋必如红2建头）EM+（8Un1.引物）fh>RIAAFAW（选择性犷增引物）立成IAGHEXU（之择性扩*弓物）&oRbAGROX1"（法界性扩增引物）马闻岬+CAA"（房界性扩增引物）班IIMP1.CAT'（充挣性扩增引物）您血MP1.CTA,（选绛性犷增引物）班加MSP1.eTr（无界性扩增弓构）5CTCG1.AGACTGCGICC-3,5'-AATTGGIACGCAGTC35GACGAGAGTCTCGAT3,5-CGATCGAGACC.AT-3,5GACTGCGTACCAATTCA3'5-GATGAGTCTCG.4ICGGC-3-5«AcTGCGTACCAATTCAAS5-GACTGCGIACC.A11CAG-3-5GACTGCGTACCM11CAC3'5-GATGAGTCTCG.AICGGCA.V3'5-GATGAGTCGACGGCAT-3'Sgatgagtctcgaicggctaj5FATGAGTCCGACGCC113上标的相同数字表示选择性扩增反应中一对引物组合Thesamenumbermthesersc11ptindicatesapairofPrimCTcombinationsmtheSeIeCt1.Veamphficaonreacncn2.2 数据处理2.2.1 不同产地广藁香MSAP位点信息参考自Schu1.z等”4及MixScoring2软件获取MSAP位点信息.2.2.2 UPGMA聚类分析及PCoA主坐标分析使用NTSYS-2.IOc软件对MSAP位点信息数据进行UPGMA聚类分析及PCoA主坐标分析，可得到197个广前香个体的树状聚类图及PCoA分析图。2.2.3 AMOVA分子方差学分析使用Ar1.eqUin-Ver3.5软件对MSAP位点信息数据进行AMOVA分析,通过MSAP位点信息计算与广祇香基因组DNA甲基化有关的广箱行物种遗传变异的来源以及各个MSAP位点的统计学意义。2.2.4 差异片段的回收测序分析根据UPGMA等分析的结果，筛选出经同组的切后，将测序分析所得到的MSAP序列信息与本课题组的广/香转录组序列进行本地BIaSI比对，以找出差异片段可能存在的基因中，哪些与广液香醉或丽的代谢通路相关。在数据计算中，多态性位点比例和Shannon多态性指数计算公式如下：多态性位点比例=多态性位点数/该类型MSAP位点总数Shannon多态性指数=2PiIOg2pi其中pi指MSAP标记中评分为“I”的标记占该种群内所有标记的百分比。3结果与分析3.1 样品DNA的检测结果系因组DNA需满足2个条件，方可进行后续实验.第一，基因组DNA经超微量紫外分光光度计检测A260/A280比值在1.71.9;第二，经1%琼脂糖涨胶电泳检测结果为仅出现条明亮的条带，无拖尾等基因组降解现象，如图1所示。不满足任意一个条件的DNA样本需重新提取检测.MAtate1.-fWWSiniAM1.>i07JmnEKAOcagnugn图1YC1.-20*ITR*KtaDXAMMSF«1G*M«kD5A4hmimmpofYC1-2OWP.ctMi3.2 毛细管凝胶电泳分析结果毛细管电冰结果如图2所示。每个样品经2组机切、6对选扩引物扩增后，共有12张荧光PCR检测图，本实验挑选2对引物的荧光枪测图作为代表说明。荧光PCR检测图中的横轴表示各个MSAP位点的bp值,纵轴表示该位点序列的DNA浓度，如图2-B中205bp处存在峰高为约1500OrfU的位点.AGRIAATAM电二5C11HI40«22JTtaIItT1.r地引物的WIa智电/图Fg.?Capdbnd<cfpbo*ot“twopansofsekcthWBf1.hficOO1.1.pttswr3.3 数据与分析3.3.1 不同产地r嘴香基因DNA的MSAP位点信息在本实验中,使用了6对选择性扩增引物时10个产地共计197个广稚香样品进行MSAP分析，一共得到2427个MSAP位点,其中类型I占33.83%,类型II占33.25%,类型III占3292%（类型划分标准见表3）。其中的1053个多态性位点内一共检测到了78297条MSAP条带，每对引物组介检测到的多态性位点数量范用是1372IO,大多数原始数据矩阵中的多态性位点经过MiXSeOring2评分方法转换后都有多种类型的MSAP条带，少数仅占一种类型。在最终得到的多态性位点中，821个包含未甲基化的DNA片段,807个DNA片段含有甲基化类型为HMECG.或MECG-（id为“M”型）的位点，799个DNA片段含有甲基化类型为HMECCG（记为“H”型）的位点。表3口nS和"$p1.酶对5(CGG位点不同甲基化类型的敏感度Tab1.e