新药临床前药物代谢动力学研究.ppt

新药临床前药物代谢动力学研究新药临床前药物代谢动力学研究 目的目的: 阐明新药在体内吸收、分布、代谢和阐明新药在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点。排泄的过程和特点。ADME 新药研发的重要环节新药研发的重要环节 ，要求研究，要求研究内容与药物的分类有关。内容与药物的分类有关。药品注册管理办法药品注册管理办法（局令第（局令第28号）号）中药、天然药物注册中药、天然药物注册28.动物药代动力学试验资料及文献资料动物药代动力学试验资料及文献资料化学药品注册化学药品注册22.复方制剂中多种成份药效、毒性、复方制剂中多种成份药效、毒性、药代动力学相互影响的试验资料及文药代动力学相互影响的试验资料及文献资料献资料27.非临床药代动力学试验资料及文献非临床药代动力学试验资料及文献资料资料21.动物药代动力学试验资料及文献资料动物药代动力学试验资料及文献资料 27.复方制剂中多种组份药效、毒性、药代复方制剂中多种组份药效、毒性、药代动力学相互影响的试验资料及文献资料动力学相互影响的试验资料及文献资料 生物制品注册生物制品注册申报资料要求申报资料要求一、生物样品分析技术的特点与要求一、生物样品分析技术的特点与要求 生物样品生物样品 ：全血、血浆、血清、粪便、全血、血浆、血清、粪便、尿液、胆汁或其他尿液、胆汁或其他 特点特点：药物浓度低药物浓度低 g/ml, ng/ml, fg/ml 干扰物质多干扰物质多 取样量少取样量少 个体的差异大个体的差异大 灵敏、专一、精确、可靠的生物样品定量分析方法灵敏、专一、精确、可靠的生物样品定量分析方法? 生物样品分析方法的建立和确证生物样品分析方法的建立和确证 1. 生物样品分析方法的选择和建立生物样品分析方法的选择和建立 （3）放射性核素标记法：标记核素有）放射性核素标记法：标记核素有3H、14C、125I。药物分布和排泄研究，物料平衡研究。药物分布和排泄研究，物料平衡研究。 125I。蛋白质。蛋白质类分析类分析1) 色谱法：色谱法：HPLC、GC、LC-MS、LC-MS/MS，GC-MS等，大多数药物的分析等，大多数药物的分析2）免疫学方法：放射免疫、酶联免疫、荧光免疫）免疫学方法：放射免疫、酶联免疫、荧光免疫等，主要用于蛋白质等，主要用于蛋白质/多肽类物质检测；多肽类物质检测；（4）微生物学方法，主要用于抗生素类药物的）微生物学方法，主要用于抗生素类药物的测定测定2生物样品分析方法的确证（生物样品分析方法的确证（Method Validation）及技术要求）及技术要求（1）特异性）特异性(Specificity) 测定的物质是受试药品的原形药物或特定活性代测定的物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性和外源性物质及其相谢物，生物样品所含内源性和外源性物质及其相应代谢物不得干扰对样品的测定应代谢物不得干扰对样品的测定 如何证明？如何证明？考察考察6个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图反映分析方法的特异性生物样品色谱图反映分析方法的特异性 如何保证？措施如何保证？措施生生物物样样品品处处理理直接沉淀处理蛋白等直接沉淀处理蛋白等液液-液提取液提取 液固提取液固提取除杂质除杂质样品富集样品富集分分离离条条件件优优化化 色谱柱的选择色谱柱的选择流动相的选流动相的选择择检检测测条条件件优优化化紫外检测器紫外检测器荧光检测器荧光检测器质谱检测器：质谱检测器：MS，MS/MS其他其他（2）标准曲线和定量范围（）标准曲线和定量范围（Calibration Curve） 原理：待测物质的浓度与响应的相关性，用回归分析原理：待测物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法获得标准曲线，提供标准曲线的线性方程和相关方法获得标准曲线，提供标准曲线的线性方程和相关系数，说明其线性相关程度系数，说明其线性相关程度 标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度 如何做？如何做？ 少少6个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物介质制备标准曲线，定量范围要能相同的生物介质制备标准曲线，定量范围要能覆盖全部待测样品浓度，不允许将定量范围外覆盖全部待测样品浓度，不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。行空白生物样品，但计算时不包括该点。至少至少5条条 实例实例1左旋泮托拉唑血浆中标准曲线左旋泮托拉唑血浆中标准曲线取空白大鼠血浆取空白大鼠血浆90 l，加，加10 l不同浓度的标准品不同浓度的标准品, 使血浆使血浆中左旋泮托拉唑浓度分别为中左旋泮托拉唑浓度分别为0、0.156、0.312、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和和40.00 g/ml，按，按“血血浆样品的处理过程浆样品的处理过程”项下操作，记录样品和内标峰面积。项下操作，记录样品和内标峰面积。利用样品浓度利用样品浓度C对样品与内标峰面积比对样品与内标峰面积比R作直线回归，得作直线回归，得左旋泮托拉唑回归方程左旋泮托拉唑回归方程R= 0.777C+0.023，线性范围，线性范围0.15640.00 g/ml，最低检测浓度，最低检测浓度0.156 g/ml。左旋泮托拉唑血样方法学标准曲线左旋泮托拉唑血样方法学标准曲线 （3） 定量下限（定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ） 定量下限是标准曲线上的最低浓度点定量下限是标准曲线上的最低浓度点 要求至少能满足测定要求至少能满足测定35个半衰期时样品中的药物个半衰期时样品中的药物浓度，或浓度，或Cmax的的1/101/20时的药物浓度，其准确时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的度应在真实浓度的80%120%范围内，范围内，RSD应小于应小于20%。应由至少。应由至少5个标准样品测试结果证明个标准样品测试结果证明 （4 4） 精密度与准确度精密度与准确度(Precision and Accuracy)(Precision and Accuracy) 要求选择高中低要求选择高中低3个浓度的质控样品同时进行方法的精个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。密度和准确度考察。低浓度选择在定量下限（低浓度选择在定量下限（LLOQ）附近，其浓度在）附近，其浓度在LLOQ的的3倍以内；倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限，通常大于工作曲线最高浓度接近于标准曲线的上限，通常大于工作曲线最高浓度高浓度80%中间选一个浓度中间选一个浓度 每一浓度每批至少测定每一浓度每批至少测定5个样品，批内变异个样品，批内变异连续测定连续测定3个分析批个分析批 批间变异批间变异变异：变异： RSD一般应小于一般应小于15%，在，在LLOQ附近附近RSD应小于应小于20%。要求：要求：准确度：一般应在准确度：一般应在85%115%范围内，在范围内，在LLOQ附附近应在近应在80%120%范围内范围内 左旋泮托拉唑批内和批间变异左旋泮托拉唑批内和批间变异取空白血浆取空白血浆100 l，加入标准品，使单一对映体浓，加入标准品，使单一对映体浓度分别为度分别为0.312，2.50和和20.00 g/ml，按，按“血浆样血浆样品的处理品的处理”项下操作，记录样品与内标峰面积比项下操作，记录样品与内标峰面积比值值R，代入当日工作曲线中算得浓度，以此作为精，代入当日工作曲线中算得浓度，以此作为精密度指标。测得批内变异和连续密度指标。测得批内变异和连续3天内的批间变异天内的批间变异(n=5)，结果见下表。，结果见下表。（5） 样品稳定性样品稳定性(Stability) 根据具根据具体情况，对含药生物样品在室温、冷体情况，对含药生物样品在室温、冷冻和冻融条件下以及不同存放时间进冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意储备液的稳放条件和时间。还应注意储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。的稳定性。WHY长期冻融稳定性试验长期冻融稳定性试验反复冻融稳定性试验反复冻融稳定性试验 室温放置室温放置 6 h 稳定性试验稳定性试验进样瓶放置进样瓶放置 24 h 稳定性试验稳定性试验 样品稳定性试验样品稳定性试验 其他其他 （6） 回收率回收率(Recovery) 高、中、低高、中、低3个浓度的提取回收率，高、中、个浓度的提取回收率，高、中、低低3个浓度的提取回收率应大于个浓度的提取回收率应大于70% 浓度设定要求同变异分析浓度设定要求同变异分析左旋泮托拉唑方法回收率左旋泮托拉唑方法回收率 EP管加入管加入90 L空白血浆，加入空白血浆，加入10L标准品，使单一对映标准品，使单一对映体浓度分别为体浓度分别为0.312，2.50和和20.00 g/ml，按，按“血浆样品血浆样品的处理的处理”项下的方法操作，记录样品峰面积和内标峰面积项下的方法操作，记录样品峰面积和内标峰面积(A1)；另取；另取EP管加入管加入10L 6.25,50和和400 g/ml消旋泮托拉消旋泮托拉唑标准品，再加入内标唑标准品，再加入内标10 L，挥干后，挥干后100 L甲醇复溶，甲醇复溶，离心，取上清进样，记录样品峰面积和内标峰面积离心，取上清进样，记录样品峰面积和内标峰面积(A2)。以峰面积的比值以峰面积的比值(A1/A2*100%)求得血浆中左旋和右旋泮托求得血浆中左旋和右旋泮托拉唑和内标的回收率。每个浓度处理拉唑和内标的回收率。每个浓度处理5份样品，结果见表份样品，结果见表 （7 7） 介质效应介质效应(Medium Effect)(Medium Effect)：由于样品中存在干扰物：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响质，对响应造成的直接或间接的影响。LC-MS LC-MS/MS 大鼠的空白血浆，按大鼠的空白血浆，按“血浆样品的处理血浆样品的处理”项下的方法操作，项下的方法操作，挥干后加入挥干后加入10 L不同浓度的标准工作液和内标液，挥干，不同浓度的标准工作液和内标液，挥干，加入加入100 L复溶液，使最终浓度相当于复溶液，使最终浓度相当于QC样品浓度，每个样品浓度，每个浓度进样浓度进样5次，记峰面积为次，记峰面积为A1；另取；另取10 L不同浓度的标准不同浓度的标准工作液和内标液，挥干，加入工作液和内标液，挥干，加入100 L复溶液，使终浓度相复溶液，使终浓度相当于当于QC样品浓度，即排除空白血浆基质的干扰，每个浓度样品浓度，即排除空白血浆基质的干扰，每个浓度进样进样5次，记峰面积为次，记峰面积为A2。如果如果A1/ A2 115%，表明有基质效应存在，表明有基质效应存在 不符合要求不符合要求（8) 方法学质控方法学质控(Quality control,QC) 由独立的人员配制不同浓度的质控样品对分析方法由独立的人员配制不同浓度的质控样品对分析方法进行考核。对操作者单盲进行考核。对操作者单盲高、中、低三个浓度的质控样品高、中、低三个浓度的质控样品 利用随行工作曲利用随行工作曲线求得测定结果线求得测定结果 每份样品重复每份样品重复6 6次次质控样品测定结果的偏差一般应小于质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓，低浓度一般应小于度一般应小于20。 2/3样品应符合要求样品应符合要求生物样品测定生物样品测定1 1）随行工作曲线）随行工作曲线2 2）伴随质控样本）伴随质控样本 高中低高中低3 3种浓度种浓度 质控样品数大于未知样品总数的质控样品数大于未知样品总数的5%5%。质控样本合理布。质控样本合理布控控3 3） 未知浓度样本的信号代入方程，计算相应样品的浓未知浓度样本的信号代入方程