Restriction endonuclease enzyme digestion限制内切酶.docx

全酶切。EeoRIStRkytMStlckytMRecoMbMrtC»«*一'前言：1950年科孥家樊现噬菌曲(phage)射大赐捍菌的不同菌株(strain)具召不同的感染实力。1962年瑞士科壁家WernerAitcr等人瞪出E.coliK菌株可羟生一值酵素能水解phage的DNA，因而耦悬限制薛素。1970年科家始利用限制醒素来鹿理白细胞分蹄出的畏脩型DNA以得到固定大小的特定DNA片段，可Bg用在基因组结横典重组DNA的探讨C二、目的：1 .揩分雕得到的飕DNA'以不同的限制酬切割，遮asarose腭?g泳分雌DNA片段彼检定Ga或截切所需DNA片段，以暹行重能DNA(recombinantplasmidDNA)之建，2 .戴照DNA:PBaC-D-Pn539-E豹7.2Kb典PET-21(+)的5.4Kb分别以限制酣BamUl舆EcdRl切割来检定plasmid的正硅性。三、原理：利用限制性内切Bl切割DNA是DNA里殂谩程中的丽键步骤之一胜利的醐明飨工作供应了有效的灾验材料。限制性内切的是细菌飕内限制修系统内部。本r运切断的内切的,根榛用其中的11型酹射DNA分子暹行切割。在前切反惬中，DNA的钝度、缎衡液中的度、Mg2+、pH值、作用潮«等因素均可影密反德一般可通遇增加酣的用量延是反愿畤冏等措施以逢到完限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)能!|寻骏股DNA切的酵素。切割方法是符M分子典磷酸之fW的健结切斯，瘦而於南保DNA鲤上各度生TH切，且不被填核昔馥舆修基切割形式有所,分别是可命突出WKDNAJ末端.以及末端平联凸起的由於新的DNA片段可由另一硬偶悬DNA速接前的酢素黏合，因此染色醴或DNAERestrictionEnzymeActionofEcoRI不同的限制片段得以较由剪接f乍用而结合在一起。EcoRlSmaIGAATrC一GCTTAAGCTTAA跖次未StiCkyendCCCGGGCCCGGGCCCGGG曲末Mbluntend限制酵素分别在特定DNA序列切割DNA形成stickyend(cohesive)（八）DNAWR(g)DNA«RCTTAAbCTTAATiIM1.E<oRW制<fftGCTTAAH用接合“使A&BDNA心成RcoombmantDNA形成bluntendGAATTCCTTAAG限制酵素的单位限制性内切酹的活性以随的活性单位unit表示，1Iwl罩位（Unit/U）指的是在反g¾聘情分20川，能遗溜度粽件下於一小8利寺尚）可揩l“gDNA分解完全的限制薛索盘限制牌的命名限制酶的命名是以的来源的原核生物的名耦扁依撼即曲的名耦的第一值!大同字母取自於易名的第TB字母其次、三佃小嘉字母取自於槿名的前丽(B字母字母接面的黑生别是面里地表明桎生物中不同限制的分融诩M底;限制能名稀的吉?方式，前三佃字母常用斜置或加下战僚表示。例如,分蹄自蜜色IMR菌(StrePtOmyCeSachromogenes)的雨樟限制酣被分别命名MSacl和Sacll。若同一生物植内又分聒不同的血清型或菌株品杀'其名耦卬J放在限制薛名稀的第三IH字母之彼。例如限制酣HincII和HindIII用J是分另庶自流感嗜血菌但aemophU5的/uenzae*qC和d血清型菌株，-/TidIII:HacmophilusinucnzacRd第三佃分触出的限制薛素-SalBAStaphylococcusaureusstrain3A-EcoRI:EscherichiacolistrainRY13-Ban:BacillusamyloliqucfacicnsH隈制薛的程贩> 已知的限制醐分悬TypeI'TypeII舆TypeIII三。> TypeI典TypeHI限制前同日等具有endonuclease典methylase的活性。> TypeI限制的曹庭檄的切割距雕辨i位置l0bp的序列，TypCnl刖只曾切割距蹄辨潢位置2426bp的序列。>Tyg11限制前，即曾尊一地切割所辨戢的核酸序列的位置一般可辨戢燹股DNA上特定的4-8佃触基，能在IS知序列内的特定位JK上切割噎股摞旋DNA。每一槿限制的能辨特定的DNA序列址加以切割，但它不佛切割细菌自己的DNA四悬细菌DNA上的切割位宜已被甲基化T肖悬restriction-modificationsystem>不同的级!菌中可触化出具不同理一性的限制薛素'可用来做基因剪接暗的I剪刀j使其成悬基因或分子道傅操作上趣悬有用的工具目前被Wf芝悉用於遇停工程、基(do11inQ和基1分析(genemapping)Cleavagesite(切制位工)typelll二林：restrictionmodificationMg*2orMna物辩婚位置均25-27bp的位J1.耨fttypeItypll如成之SUbUnit穆Si三段：一检：specificity:M堆位置restrictionrestriction:具内切够活性modification:具基峰活性我行CndOnUCleaseMg*2,ATPMg*2作用暗所需之帕因子S-adenosylmethionine(SAM)雄制XS位置的100ObP只在将定加弊以外的任何位置位置内或旁造第一型限制睥同畤具有修ft(modificalk>n)及12知切割(rc$lric【ion)的作用：另有熬知(recogn1ze)DNA上特定基序列的实力，通常其切割位(CIeaVageSiIe)距知位(攸OSniIionSile)可逢救干他崎基之道,址不能举硅定位切割位算i所以她不常用。例如：EcoB、EcoK。其次型限制廨只具有知切割的f乍用，修脚作用由其他薛素迤行。所熬知的位置多熟短的码文序列(Mindromesequence)：所剪切的i法序列通常即舄所熬知的序列。是遭傅工程上C用性敕高的限制酶，例如：EcoRI、HindIII。>第三型限制博典第一型限制醐似同畤具有修肺及熬知切割的作用。可熬知短的不封耦序列切割位舆知序列名勺矩24-26堪封她不能举硅定位切割位黠-所以她不常用。例如：EcoPI'Hin1111。上第II型限制酶>第11型限制酹只曾辨熬特定短的DNA序列，因此IK泛被堰用於基因工程的技衙上'目前商品化的,至品许多，可由生技公司脸得。此槿限制酣曾辨熬畏度4Ybps(或更是)等不同的核甘酸序列很举硅的在某一站上切DNA成轲稠的阚物交互分-追撞交互切口曾使DNA片段的5'和3'悠空成stickyend(orcohesiveend突出湍) Palindrome：5.GAATT3,3CTTAAG5, Dyadsymmetry(two-foldsymmetry)限制酵素其HXOgnitiOnSite的核苦酸序列的度：四低!核甘酸的tetramer五他核甘酸的pentamer六值!核甘酸的hexamcr八他核甘酸的OCIomer-XrecognitionSitC愈长,此Site出现在【)、A上的概率愈小切割位愈少 Isoschizomcr(同裂酶)：不同限制薛素辨婚相同DNA序列切相同位置：perfectisoschizomcr一切不同位置：impcrfbctisoschizomcrTypeIlrestrictionendonucleaseECORlCieaVgHindIlcleavage1：E：;二:.(protruding;overhang)Cohesiveend(Stickynd)3'-Kv<lrovlHITAIM/一'1j/一二一二二二Hx*二二-:r十7+<l二二二-一/广；二-l<tf*Ec2/T1.一l/一上常冕的内限制酶及其辨畿的切位博案名稿权切法氏ORIEscherichiaCCIi5,GAATTC3'CTTAAG5-GAATTC-3'3,-CTTAAG5'gw"HlBaCiHmsWYloliaMefaCieM5GGTCC3'CCTAGG5GGATCC-3,3CCTAGG5'Haemophilusinfluenzae5'AAGCTT3TCGAX5,-AAGC11T-3'3'TTCGA-5'Thennusaquatias5TCGA3'AGCT5'TCGA-3'3'-AGCT-5'NotlNOCaMiaOliIidiS5,GCGGCCGC3CGCCGGCG5GCGGCCGC-3'3CGCCGGCG-5'HinnHaemophilusinfluenzae5,GANTC3'CTNAG5-GANTC-3'3'CTNAG-5'SW3AStaphylococcusaureus5,GATC3,CTAG5'-GATC-3'3'-CTAG3'PwProIeMSVMka由5,CAGCTG3'GTCGC5-CAGCTG-3'3QCGAC-5'S"ul*SeEUiama/re$re$5,CCCGGG3'GGGCCC5-CCCGGG-3'3-GGGCCC-5'HaOicphiluse”沁C5,GGCC3,CCGG5'-GGCC-3'3,-CCGG-5'Alnl4ArIhtVbacIerhueus5,AGC1'3wCGA5AGCT3,3'-TCGA5'A"RV*Escherichiacoli5'GATATC3'CTATAG5,-GATATC-3'3'-CTATAG5'Kpnl人7"八储5GGTACC3,CCATGG5'-GGTACC-3'3'-CCATGG-5'PstlProNdenciuSluarlii5,CTGCAG3'GCGTC5CTGCAG3'3,-GACGTC-5'SaHSlrePICMyceSachromcgene*5,GAGCTC3'CTCGAG5GAGCTC-3'3-CTCGAG-5'Sitvp”>mcesalbue5,GTCGC3,CAGCTG5GTCGAC-3'3CAGCTG-5'SRhlStreptomvcexphaeoclm)tnoRttneS5,GCATGC3,CGTCG5-GCATGC-3'3CGTACG5'×biXanthemonaSbadHi5TCTAGA3,AGATCT5,-TCTAGA-3,3'-AGATCT5'*=平滑末喻Hume