qPCR概述重要.docx

一般来讲,进行real-timeqPCRMasterMix都是2*的浓缩液,只须要加入模板和引物就可以。由于real-timeqPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析，通常来讲反应体系的引物终浓度为100-400mM:模板假如是总RNA一般是Iong-500.假如cDNA.通常状况下是Iul或者13的10倍稀释液,要依据目的基因的表达丰度进行调整:当然这些都是阅历值.在操作过程中,还须要依抠所用MaSterMlX.模板和弓I物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系.在反应体系配置过程中.有下面几点须要留意：IMaSterMiX不要反复冻融，例如常常运用，最好溶解后放在4度，2.配制MIX进行，削减加样误差。最好能在冰上操作，3每首或每孔都要换新怆头I不要连续用同一个枪头加样!4全部成分加完后，离心去除气泡.5.每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料(refe<encedye.PaSSACdye)常用的是RoXTM(现在已经是ABl的注册商标了!)或者其他染料,只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定反应中的非PCR震荡.校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，供应一个稳定的基线.现在很多公司已经把ROXTM配制在MaSterMiX或者Premixture里.假如反应曲线良好或已经优化好反应体系.也可以不加RoXTM染料校正。通常来讲,real-timeqPCR的反应程序不须要像常规的PCR那样，要变性、退火、延长3步。由于其产物长度在80-15ObP之间，所以只须要变性和退火就可以了.SYBRGreen等染料法，最好在PCR扩增程序结束后.加一个溶解程序,来形成溶解曲线,推断PCR产物的牯异性扩增：而溶解程序,仪器都有默认设置.或稍有不同.但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集，仪器设置全部仪器的操作都基本一样,设IJ的时候包括反应板设置(platesetup)和程序设置(programsetup),我们以ABlStePOne为例,具体看一下反应设置：A.首先是试验目的选择：定量还是其他。我们命名为,BioTeke-.进行“定量试验：B.试验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBRGreen方法,Fast程序,以CDNA为模板进行。C目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称.D.样SI的设置包括哪个是试算组.哪个是比照组,以及负比照的设置和生物重复的设置，£比照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做打算F.反应程序的设置：PCR反应程序的设置要依据不同公司的MaStefMK比如B>oTeke的95C°2分钟就可以激活DNA聚合酹(ABI的须要10分钟八循环反应是95C515秒，60CCl5秒的40个循环.溶解曲线程序采纳仪器既认设置就可以“或者是仪器说明书上建议的程序。G.反应体系的设置：A-G这五个步骤简洁设置好.可以保存.修改反应程序或者立即迸行反应。须要留意一点ABl仪器须要加ROX参比染料,默认的是RoX。有些公司是把RoX或者其他染料配制在MaSteMIX里面；也有的是单独分开。要依据不同公司的MaSterMiX进行这一个步骤的选择，&。Teke的MaSterMIX里没有参比染料.所以选择“none'设置好之后.就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN!Real-timeqPCR数据分析IRea1.bmeqPCR常见参数基线(baseline)通常.同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线闺值(threshold自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍.手动设置：置于指数扩增期,刚好可以清晰地看到荧光信号明显增加。同一次反应中针对不同的基因可单独设置闺值,但对于同一个基因扩增肯定要用同一个阈值.Ct伯与起始浓度的对数成线IO哪些种类的反应管和盖子适合定PCR试验运用？有何冬要留意的地方？定员PCR试蕤可以运用以下耗材：96孔光学反应板t办作光学鹿0.2ml光学八联反应管协作光学膜,02ml光学八联反应管协作平美的光学八联管盖:ABl公司生产的定量PCR耗材。I1.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？当运行实时定量PCR仪及运用软件分析试验结果时,计算机会垠除并创建若干文件.计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以分斛的碎片存储时.程序须要更长的时间才能存取文件,因为必需多次找寻文件碎片以存取不同的片断，碎片整理好用程序将一个文件分献开的多个碎片合并在一起.并存储到硬盘的同一个位置从而清除文件碎片,进而优化系统性能.碎片整理的方法如下在WindoWS桌面上.选择起先（Start）.我的电脑（MyCOmPUte0。在（我的电脑）窗口中.用鼠标右键单击硬盘驱动器.并选择（应性property。在（属性）对话框中选择工具（T。IS）选项卡，单击起先整理（Defragmentnow）i单击碎片整理（Defragmen小当显示,碎片整理完毕"对话框时.单击（璃定）。在.本地磁盘属性,对话框中.单击（璃定）。为计算机机中剁余的驱动器重复如上步骐，12.何时执行WindoWSSerViCePaCk更新？不要执行该操作.除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统否则请不要更新限制定PCR仪的计算机的操作系统。新版本的MicrosoftWdows操作系统有可能与SDS软件存在冲突.并导致仪器不能正常运行.假如您希望安装SerViCePaCk（更新包）以更新操作系统.应查看随SDS软件供应的版本说明.避开兼容性问题，13应当备份哪些数据？应当定期备份您的试蛤数据备份频率举荐每周一次,用光盘刻录。同时您也应当备份定量PCR仪的各种纯荧光光谙校正文件、背景文件和安装险证明验数据,这些文件所在的书目是CjAppliedbiosystemsZSDSDocumeg14.怎么样的试验室环境才能保证仪就设备正常运行？良好的试彩室环境有助于延长仪器的运用寿命,削减仪器出故萍的频率。举荐做到以下几个方面：电源：举荐配备合适的UPS或稳压器.通风:仪器的通风应当没有阻挡.温度：举荐试验室配备空调，温度应当限制在10-30oC之间，湿度：20-8OM；对于潮湿的省份.举荐试验室配备除湿机。空间：易于操作，平安。15怎样推断定量PCr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？一个法是运行背景校正反应板,当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号.则表明该孔可能被荧光污染物。另外一种法是在不放任何物品到样本块上的前提下.执行Rol的校正.当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加块块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中.吹打数次,将废液吸入废液杯中。重型以上步骤：乙醇三次,去弟子水三次。璃认反应孔中的残留液体蒸发完.16.什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？背景校正程序测量定岗PCR仪所运用的反应管和水的空白英光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收集的温度为60。防后.SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均侑，捉取结果并保存到校正文件中,软件在今后的分析中将自动调用此校正文件.从试皴数据中扣除背景佶号。因为背景荧光的信号强度随著很多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变更，所以举荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。.什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度,通俗地说是让仪器*相识各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息：以后每次定量试验运行过程中,SDS软件收集样品的原始光谱信号.并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精端扣除不同染料的信号出部分从而哨定样品中的荧光染料种类和信号福度.举荐每半年进行一次纯荧光校正.在运行光滑校正之前.请先进行背景校正和ROl校正。1896孔板怎样封膜？当运用96孔板做试醛的时候,举荐运用光学膜代替盖子来密封反应孔.正确的封祺方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向.最终沿着板的边缘按压使之密封。19 .运用单管或8连管做试验时，在样品加热块上应当怎样支配放置？运用单管或8连管做武骏，并且样本数量不多的时候，建议在样品加炖块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后渐渐向两边放Jt.这样做的好处是热差压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受熟都比较匀称，提高孔与孔之间的数据精密性.20 .肯定定量与相对定量有什么区分？肯定定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数.相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含的相对比例,而不须要知道它们在每个样本中的拷贝数.举例来说,伤如探讨项目中包括处理过的和未经处理的比照样本.通常可以将未经处理的样本指定为基准.规定其目的基因浓度为100,将经处理的样本的定量结果就以比照样品的定量结果就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比“肯定定量试脸必需运用已知拷贝数的肯定标准品,必需做标准曲线.相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线，相对定试验有两种方法：标准曲线法和CT值比蛟法，假如运用标准曲线法.可以运用肯定标准品，也可以运用相对标准品而且相对标准品在试轮操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不须要知道其分子数目的标准品典型的做法是将一个巳知pg数的样品做一系列梯度稀稀，CT侑比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系.来计算不同样本之间的相对百分比。肯定定量的数据易于理解.但是肯定标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有很多商业性的标准品试附盒供选购.可以解决这种困难相对定量的标准品简洁在试胎室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对试脸数据的说明有肯定难度.21 .定PCR基因表达的试睑数据应当如何处理？做的来说，有三个层次的校正是必须要做的。首先，参比信号校正。试剂中必需包含固定浓度的ROX.这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管差透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除,使数据真正反映PCR进程.ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性，其次.内比照校正。试蛤中加入样品基本上都是以体积为单位的.但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将试验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因(如11-2)的同时定量一个内比照基因(如18SRNA基因),然后11.218S,内比照校正使不同样品的试验数据可以相互比较。笫三，计算相对于基准样品(CalibratOr)的相对基因含量、比如探讨处理和未处理的、O小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别.则须要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常22 .标准曲线法相对定的数据应当怎么处理？悠设试验的目标是探讨药物处理后0、24、48小时I1.-2基因在某种组织中的表达量的变更.所用的内比照是18SRNA基因。I1.-2和18SRNA的测定结果都是总RNA的Pg数，数据的处理方法见下表：23 .什么是CT值比较法？数据怎么处理？CT值与起始DNA浓度的对数成反比：假如不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%,可以从上面的公式推出相对含量(XOlX02)=2-CT.假设试缝的目标是探讨药物处理后0、24、48小时11-2基因在某种组织中的表达量的变更，所用内比原是18SRNA基因。I1.-2和18SR