Let 7b及肿瘤坏死因子α在重度子痫前期胎盘组织中的表达及意义.docx

let-7b及肿瘤坏死因子在重度子痫前期胎盘组织中的表达及意义目的探讨let-7b和肿瘤坏死因子a(TNF-a)在重度子痫前期(SPE)患者胎盘组织的表达情况及临床意义。方法选取2017年8月至2018年10月于医科大学附属第一医院剖宫产术分娩的产妇50例，SPE产妇(SPE组)30例，健康孕产妇(NC组)20例，均为单胎妊娠。QRT-PCR及Western-blot检测两组胎盘组织中let-7b>TNF-amRNA及其蛋白的表达水平，统计分析两者相关性及临床意义。结果let-7b在SPE组的相对表达明显低于对照组(0.07±0.01vs.0.23±0.03,P<0.05);TNF-amRNA在SPE组的表达明显高于对照组(0.47±0.05vs.0.19±0.02,PV0.05)；TNF-a蛋白在SPE组表达显著增高(1.ol±0.11vs.0.55±0.04,P<0.05);let-7b和TNF-a显著负相关(r=-0.41,P<0.05);SPE组与对照组孕产妇的血压及新生儿出生体重相比差异显著收缩压(163.80±4.67)mmHgvs.(124.90±2.16)mmHg,舒张压(108.30±3.06)mmHgvs.(76.62÷2.63)mmHg,新生儿出生体重(2505.00÷162.60)gvs.(3593.00±154.50)g,P<0.05;SPE组胎盘组织TNF-Q的表达与收缩压及舒张压显著正相关(r=0.92和0.90,P<0.05)o结论E-7b可能通过负向调控TNF-a的表达，参与了SPE的发生和发展。关键词：重度子痫前期；胎盘；let-7b;肿瘤坏死因子a重度子痫前期(severepreeclampsia,SPE)是一种妊娠特有疾病，是产妇和围产儿死亡率升高的主要原因，但是具体发病机制仍不清楚，基于其临床发病及预后特点，胎盘功能障碍被认为是关键因素1.l1.miRNA是一类内源性的非编码小RNA,几乎在所有的细胞中都有存在，主要影响细胞的发育、分化及转录调控。研究发现，在子痫前期发生和发展过程中都存在miRNA的差异性表达，let-7就是其中之一。并且Zhang等2已经证实重度子痫前期(Severepreeclampsia,SPE)孕妇胎盘中let-7表达明显下调。let-7b是let-7家族成员之一，由此我们可以推测let-7b可能参与了重度子痫前期的发病。肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-,TNF-a)是一种重要的炎症因子，与血管内皮细胞的损伤及细胞的凋亡关系密切3,而子痫前期的基本病理变化之一正是血管内皮细胞受损。Nematian等4已经在子宫内膜异位症患者的血清以及相关细胞系中证实let-7b可以调控TNF-Q的表达，从而促进细胞的炎症反应，导致细胞凋亡的增加和血管内皮的损伤；然而，let-7b在重度子痫前期的表达情况及对TNF-a调控报道甚少，本研究拟通过分析SPE胎盘组织中let-7b及其下游调控的炎症因子TNF-a的表达及相关性，进一步为重度子痫前期发病机制提供理论依据。1资料与方法1.1 研究对象选取2017年8月至2018年10月于医科大学附属第一医院住院并且行剖宫产术分娩的30例重度子痫前期患者(SPE组)，具体诊断标准参考第9版妇产科学5,同期行剖宫产分娩的健康孕产妇20例作为对照组，两组均为单胎妊娠且胎儿发育无异常，无特殊合并症，既往无原发性糖尿病、高血压，无系统性红斑狼疮等相关病史。参与本研究所有研究对象均知情并签署知情同意书。1.2 标本的采集选择胎盘母体面的无钙化区，剪取全层胎盘组织，迅速用无菌生理盐水清洗干净血块和血液,干纱布净除水分,分割成大小约IemXIemXlCm的块状，放入冻存管，于80冰箱保存。1.3 总RNA提取及qRT-PCR检测常规使用TRIZol法(美国InVitrOgen公司)于胎盘组织中提取总RNA,后采用紫外分光光度计对RNA纯度以及浓度进行检测，逆转录试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKit(TakaRa,大连宝生物公司)、miRNAFirst-StandSynthesisKit(miRNA,TakaRa)分别合成cDNA,用ThermalCycleDice荧光定量PCR仪分别对其进行定量检测，根据Takara公司的SYBRPremixExTaqTMI11说明书配置反应溶液，let-7b扩展条件95°C5min；9510s,60°C50s,35个循环；TNF-a为9530s,955s,55°C30s,7230s,45个循环，分析其溶解曲线及循环阈值(CT值)，采用2-ACt方法计算其相对表达量，并进行统计分析。引物序列见表1。表1引物序列基因名引物序列let-7bF：TgaggtagtaggttgtgtggttR：GCTGTCAACGATACGCTzCCTAU6F：CtcgcttcggcagcacaR：AACGCTTCCGAATTTGCGTTNF-F：CctctctctaatcagccctctggR：TATCTCTCGCTCCCGCCMT-actinF：TaggcggactgttactgagcR：Tgctccaaccaactgctgtc1.4 Westernblot检测TNF-蛋白取少量胎盘组织常规提取总蛋白，测定其浓度(BCA,上海碧云天公司)，并且将蛋白总量调整为一致，变性后进行上样以及凝胶电泳，10OV恒压转膜50min,5%的脱脂奶粉于室温下封闭Ih,兔抗人-TNF-Q单克隆抗体(Abeam,1:500),-actin(proteintech,1:3000)4过夜，加入二抗，室温lh,EC1.(公司)显影，其灰度值采用ImageJ软件进行分析，并计算其蛋白含量。1.5 统计学处理运用SPSS18.0及GraPhPadprism6.0对所有数据进行处理分析，所有计量资料结果采用均数土标准差表示，独立样本t检验进行组间比较，PearSOn进行相关性分析，PVO.05为差异有统计学意义。2结果2.1 研究对象一般资料比较相较于对照组,SPE组孕产妇血压升高明显(P<0.05),新生儿出生体重显著降低(PV0.05),孕产妇的年龄、身高、孕周以及体重指数差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。表2两组般情况比较ffi9l年龄(岁)BMI体3bkg)A<cm)孕周(周)收iHi(mmHg)舒张压<mmHg)新生儿出生体iK(g)3l.08±2.4731.75x6.9183.54±18.42I62.2O±5.3O38.6O±O.81I24.9O±2.1676.62x2.633593.00x154.50SPEffl32.4l±5.3632.53x4.1485.35±l0.72I62.1O±3.5O37.7O±l.O9163.0x4.67,1IO8.3O±3.O6,2505.00tl62.60,注对照加Ui.P<0052.2 胎盘组织let-7b和TNF-Q的表达及其相关性。221胎盘组织中let-7b的表达水平对照组let7b的表达水平为0.23±0.03,SPE组为0.07±0.01,其相较于对照组明显降低，且差异有统计学意义(P<0.05)o见图1。CCCvv*sl<Bsqc主vuf三E图1图-71）在SPE组和NC组胎盆组织的相对表达水平2.2.2 胎盘组织中TNF-amRNA的表达对照组TNF-amRNA表达水平为0.19±0.02,SPE组为0.47±0.05,其显著高于对照组（PV0.05）。见图2。SPE纠与对照组比较,*PvOO5II.85.420评W汨*(xlsAld7VNH1.U图2TNF-在SPE组和Ne组胎盘组织的相对表达水平2.2.3 胎盘组织TNF-的蛋白表达水平Westernblot结果示SPE组TNF-Q蛋白表达水平显著高于对照组（1.OI±0.11vs.0.55±0.04,P<0.05）o见图3。Q5。5却三1三五距与对照组比较*PvO.O5图3WesternM(M检测两组胎盘组织TNF-a蛋白的表达水平2.2.4 let-7b及TNF-Q的相关性采用Pearson检验对SPE组孕产妇胎盘中let-7b与TNF-mRNA进行相关性分析。结果表明，let-7b与TNF-a呈显著负相关(r=-0.41,P<0.05)见图4。mUHNH图4重度了痛前期胎盘组织中1.l-7b和TNF-a表达的相关性2.2.5 相关分析结果我们分析了重度子痫前期孕产妇年龄、身高、孕周、BMk血压以及新生儿出生体重与胎盘组织中let-7b及TNF-a的相关性，发现TNF-a与孕产妇的收缩压及舒张压呈正相关，且具有统计学意义。见表3。表3相关性分析项目let-7bTNF-anPnP孕周0.16>0.050.45>0.05收缩压-0.39>0.050.920<0.05舒张压0.01>0.050.90°<0.05新生儿出牛体币0.05>0.050.04>0.05注：1)与对照组比较：尸0.053讨论重度子痫前期是严重的妊娠并发症之一，是导致母儿死亡以及造成母体多器官损伤的重要原因，因此，探索其具体发病机制，寻找其相关调节基因具有重要意义。研究表明，子痫前期的发病与miRNA差异性表达及大量炎症因子激活导致的血管内皮损伤关系密切6。我们通过研究SPE孕产妇与正常孕产妇胎盘组织中let-7b及TNF-的表达水平及相关分析，发现let-7b于SPE组表达水平降低明显，TNF-amRNA及其蛋白水平明显较高，且let-7b与TNF-Q呈明显负相关，提示let-7b可能通过负向调控TNF-Q参与了SPE的发病及发展过程。let-7b是let-7家族的一员，let-7家族则是最早被研究的miRNAs之一，let-7家族共有8个位点12个成员,分别为let-7a-l,-2,-3；let-7b;let-7c;let-7d;let-7e;let-7f-l,-2；let-7g;let-7i;miR-987。let-7对细胞的发育和分化具有重要作用，主要参与炎症疾病、免疫疾病及癌症的发生和发展8。多项研究表明，let-7家族成员常作为抑癌基因影响癌细胞的迁移、侵袭及转移9,胎盘中的滋养细胞在增殖和侵袭能力等行为与癌细胞高度相似1.lO-Il1.E-7在肺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种癌症中的表达均较低，由此，我们猜测let-7b在重度子痫前期患者胎盘中为低表达，并且我们的研究也证实了此猜测。TNRa是CarSWeII于1975年发现的一种非糖基化蛋白，又称为促炎性细胞因子，是H1.A系统20个基因之一，对调节细胞的增殖和凋亡有重要作用，同时其作为内源性致热源，也可以引起机体发热以及炎症的发生，对于妊娠，在调节着床，胎盘炎症及妊娠结果等机制中都有重要作用1.12-14oPE胎盘功能障碍的一个重要特征就是滋养细胞增加的炎性反应，有证据表明，PE胎盘中TNF-a表达显著增加15。此外，TNF-a高表达能够降低滋养细胞的侵袭能力16,这与我们的结果相一致，推测TNF-a在滋养细胞中可能参与调控其侵袭能力，当其侵袭能力降低时，伴随有胎盘的氧化应激增加，继而滋养细胞坏死增加，由于大量的坏死物质进入血液循环，导致血管内皮细胞的损伤增加，继而出现妊娠期血压增高表现。Brennan等17在动脉粥样硬化中证实let-