GB_T42470-2023纳米技术基于斑马鱼胚胎的纳米材料毒性评价.docx

ICS07.120CCSC04OB中华人民共和国国家标准GB/T424702023纳米技术基于斑马鱼胚胎的纳米材料毒性评价NanotechnologiesAssessmentofnanomaterialtoxicityusingdechorionatedzebrafishembryo(ISOTS22082:2020,MOD)2023-03T7发布2023To-Ol实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会目次前言I引言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14缩略语25材料25.1 生物体（斑马鱼，Daniorerio）25.2 储备液35.3 阳性对照36设备36.1 技术设备36.2 分析仪器37步骤47.1 养殖47.2 产卵刺激47.3 胚胎破膜57.4 纳米材料储备液的制备67.5 试验浓度67.6 纳米材料的分散67.7 阳性对照化学物：3,4-二氯苯胺67.8 试验方法77.9 数据分析88试验报告88.1 试验步骤88.2 报告中包含的信息8附录A（资料性）机械破膜法10附录B（资料性）斑马鱼胚胎产卵步骤11附录C（资料性）结果验证12参考文献13前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件修改采用IS0/TS22082:2020纳米技术基于斑马鱼胚胎的纳米材料毒性评价，文件类型由ISo的技术规范调整为我国的国家标准。本文件与IS0/TS22082:2020的技术差异及其原因如下：一原图1不符合5.1描述中雌鱼大雄鱼小的形态特征，因此更改了图1中雄性及雌性斑马鱼图片（见图1）；在5.2中增加了注释内容，引用国家标准对纯净水的质量做了说明（见5.2）;一一在5.2中增加了对后文储备液配置方法部分的引用（见5.2）;6.1.2中光照周期不符合常规实验及国内惯例，故引用相关国家标准，更改了光照周期的数值（见6.1.2）;一按照国内惯例，在7.3.2增加了“分析纯”来界定化学品的纯度级别（见7.3.2）;7.8.3中试验步骤需顺序进行，因此更改了各步骤前的“一”符号，将其修改为英文字母编号（见7.8.3）<,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国科学院提出。本文件由全国纳米技术标准化技术委员会（SAGTC279）归口。本文件起草单位：首都医科大学、中国医学科学院基础医学研究所。本文件主要起草人：孙志伟、李阳、段军超、陈月月、李艳博、许海燕、孟洁。鱼类试验是广泛应用于评价水环境中化学物毒性的重要手段。然而，使用包括鱼在内的脊椎动物对化学物进行测试存在动物福利问题。用已发育完全的幼鱼进行测试会给动物带来明显不适（如使用OECDTG203）,使用生命早期的鱼胚胎而不是成鱼或幼鱼进行测试是一种更符合动物福利的替代方法。纳米技术正在诸多领域发挥积极作用，但人们仍然对纳米产品的环境潜在危害有所担忧。经济合作与发展组织（OECD）使用鱼胚胎评估急性毒性的试验指南（见OECDTG236）指出，有些化学物可能不适用这一方法进行试验，如分子量23kDa的大分子结构物质和引起孵化延迟的物质。卵膜是鱼胚胎最外层的非细胞包膜，其屏隙作用会妨碍化学物或纳米材料生物活性的评价，目前尚无法预测哪些纳米材料受到该屏障的影响。使用去卵膜胚胎进行毒性评估尽管不能提供直接的生态毒理学信息，但可能有助于更好地识别具有潜在危害的纳米材料。因此，世界各国的研究人员已开发了很多方法，去除生命早期阶段斑马鱼胚胎的卵膜45。去除胚胎卵膜有两种方法：酮破膜法和机械破膜法。与机械破膜法相比，酶破膜法具有如下优点（见附录A）:节省时间和劳动力、可避免胚胎的机械损伤，同时能提供大量破膜胚胎进行高通量测试。但酶破膜法的一个不足之处在于链霉蛋白酶活性的变化可能影响卵膜去除的成功率。许多研究小组已经使用去卵膜胚胎进行化学物和纳米材料的毒性评价69,但方法尚未完全标准化1卜口3。去卵膜斑马鱼胚胎可作为其他脊椎动物系统的替代系统，用于检测纳米材料的潜在危害。随着高等动物模型毒性试验的不断优化，对替代试验方法的需求在持续增加。生命早期阶段的斑马鱼（独立摄食前，即受精后12Oh内）是一种非常好的体内毒性试验替代模型2328°与其他动物模型相比，斑马鱼模型有许多优势，包括相对容易饲养和繁殖、繁殖力强（体外受精、一条雌鱼可产200个300个胚胎）、发育周期短（约3个月成年）、基因组资源的可获得性（完整的斑马鱼基因组序列）以及基因与人类的相似性。与人类基因组的比对表明，大约70%的人类基因在斑马鱼中存在至少一个同源基因4,因此斑马鱼已经越来越多地应用于化学物毒性评价。本文件提供了使用去卵膜斑马鱼胚胎进行毒性评价的方法，推荐了去除斑马鱼胚胎卵膜的一种优化程序，同时讨论了采用去卵膜胚胎进行鱼类毒性评价的优点。纳米技术基于斑马鱼胚胎的纳米材料毒性评价1范围本文件规定了一种快速评价纳米材料毒性的方法(鱼类生命早期阶段，0HPF-120HPF),包括去除卵膜的详细操作步骤和使用去卵膜斑马鱼胚胎评价纳米材料毒性的完整方案。本文件的重点是测试纳米材料的毒性。本文件适用于商业化及非商业化纳米材料的毒性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T66822008分析实验室用水规格和试验方法IS0/TS12805纳米技术材料规范纳米物体特征指南(NanOtCChnolOgieSMaterialsspecificationsGuidanceonspecifyingnano-objects)注：GB/T371562018纳米技术材料规范纳米物体特性指南(ISO/TS12805:2011,IDT)ISO/TR13014纳米技术纳米材料毒理学评价前理化性质表征指南(NanOteChnolOgieS-Guidanceonphysico-chemicalcharacterizationofengineerednanoscalematerialsfortoxicologicassessment)注：GB/T392612020纳米技术纳米材料毒理学评价前理化性质表征指南(ISO/TR13014:2012,IDT)IS0/TS17200纳米技术粉体纳米颗粒表征和测量(NanOteChnolOgyNanoparticlesinpowderform-Characteristicsandmeasurements)IS0TR18196纳米技术纳米物体表征用测量技术矩阵(NanotechnologiesMeasurementtechniquematrixforthecharacterizationofnano-objects)注：GB/T412O42021纳米技术纳米物体表征用测量技术矩阵(ISO/TR18196:2016,MoD)ISO22412粒度分析动态光散射法(PartiClesizeanalysisDynamiclightScattering(D1.S)ISO/TS80004-1纳米科技术语第1部分：核心术语(NanoteChnolOgieSVocabulary-Part1:Coreterms)注：GBT30544.12014纳米科技术语第1部分：核心术语(ISO/TS80001-1:2010,1DT)ISO/TS80004-2纳米科技术语第2部分：纳米物体(NarK)technologiesVocabularyPart2:Nano-objects)OECDTG236:鱼胚胎急性毒性试验OECD化学品测试指南第2部分.OECD出版社，巴黎，2013(TestNo.236:FishEmbryoAcuteToxicity(FET)Test,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals.Section2.OECDPublishing,Paris,2013)3术语和定义ISO/TS12805、ISO/TR13014、ISO/TS17200、ISO/TS80004-1>ISO/TS80004-2、OECDTG236界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1增溶剂solubilizingagent在溶液中起到分散和稳定纳米材料作用的溶剂或分散剂。3.2产卵spawning将卵排到水中受精。3.3阳性对照positivecontrol通过特定的测试方法进行评价时，可以证明测试系统的适用性，即在测试系统中产生可重复的、适当的阳性或反应性的任何充分表征的材料或物质。来源：ISO10993-10:2010,3.143.4剂探索试验range-findingtest简化的急性试验，将试验生物体暴露在大剂量范围的纳米材料试验溶液中，以确定用于正式试验的浓度范围。注：该试验包括至少5浓度的纳米材料处理组和未经处理的对照组。来源：OECDTG236:2013,有修改3.5半数致死浓度1.C$0有毒物质导致一组试验生物体半数(50%)死亡的浓度。注：通常该物质的暴露水平是连续的，IJCso是根据个特定的暴露期来定义的。来源：ISO6107-3:1993,39,有修改4缩略语下列缩略语适用于本文件：DO:溶解氧(dissolvedoxygen)DPF:受精后天数(daypostfertilization)EM:胚胎培养基(embryomedia)HPF:受精后小时数(hourpostfertilization)NOAE1.:未观察到有害作用水平(noobservedadverseeffectlevel)5材料5.1 生物体GS马鱼，Daniorerio)斑马鱼(见图D是鲤科的一种热带淡水硬骨鱼，自然分布在印度、巴基斯坦、孟加拉国、尼泊尔和缅甸。成年斑马鱼的平均体长为2cm3cm,并有蓝色条纹，类似于斑马的身体侧面。成年雄性斑马鱼的身体较瘦，有蓝色和金色条纹。雌性斑马鱼腹部发白，身体比雄性大，有银色而非金色条纹。斑马鱼可以在水族箱中饲养和繁殖，器官发生在5个DPF内完成，约3个月成年，寿命约为2年3年。a）雄性b）雌性图1斑马鱼5.2 储备液使用纯净水现用现配（见7.4）。实验室用水达到GB/T66822008中规定的最低标准。5.3 阳性对照3,4-二氯苯胺（3,4-DCA）（CAS#95-76-1）。6设备6.1 技术设备6.1.1 容器可以使用多孔板（6孔或12孔）进行化学物暴露。为防止水分在暴露过程中蒸发，宜使用生物相容性基材（如封口膜或透明的自粘箔）密封容器。6.1.2 孵化器孵化温度控制在27C±1,光照周期控制为14:10（08：暗）（见GB/T396492020）.注：原ISO技术规范中光照周期为10:14（明：暗）,但这一光照周期不符合常规试验及国内惯例，故将光照周期修改为14:10（明：暗）。6.1.3 显微镜体视或倒置显微镜，放大倍数不低于80倍。6.1.4 K三M通常由一个互相匹配的产卵框和一个稍大的收集缸组成，尺寸不限。产卵框底部的网格尺寸为2mm±0.5mm,可使排放的卵立刻掉落，以