肠道菌群与冠状动脉疾病的发生风险.docx

一、引言肠道菌群在人类健康中发挥着重要作用。数以万亿计的微生物定植在人类的肠道中，其中大部分是细菌。这些肠道微生物帮助人体建立免疫系统、抑制病原菌生长、发酵未消化的膳食纤维以产生短链脂肪酸(Short-Chainfattyacids,SCFA),并产生维生素。由于肠道菌群产生的代谢产物可作用于肠外器官，因此肠道菌群也被认为是一个内分泌器官。肠道菌群调控着脂肪组织的增生肥大、肠道屏障和葡萄糖代谢功能。在正常的生理条件下，致病微生物和有益的共生微生物处于一种平衡状态。一旦这种平衡被打破，就会导致致病微生物的快速增长，即出现菌群失调。菌群失调可引起多种与肠道微生物相关的疾病，如胃溃疡、炎症性肠病、肥胖症、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAF1.D)、肝硬化、结肠癌、过敏性疾病、心血管疾病(CardiOVaSCUIardiSeaSe,CVD)、阿尔茨海默病、自闭症、注意力缺陷/多动障碍(attention-deficit/hyperactivitydisorder,ADHD)和帕金森病。最近，肠道菌群在心血管疾病发生发展中的作用引起学界注意，多个团队报道了冠状动脉疾病(CorOnaryarterydiSeaSe,CAD)状态下肠道菌群发生的变化，但不同的队列中CVD患者的菌群富集程度相异。此外，肠道菌群结构会随着年龄和饮食结构改变而变化。因此，肠道菌群与CVD的关系需要更多独立的队列研究进行进一步验证，以确定何种肠道菌群是与CVD相关的可靠标志物。肠道菌群通过代谢产物参与CVD发生。迄今为止，已发现与CVD在机制上有因果关系的肠道菌群衍生的代谢物包括氧化三甲胺（trimethylamineN-oxide,TMAO）对甲酚硫酸酯和硫酸口引味酯。其他可能对CVD起到保护作用的肠道菌群代谢产物有SCFA、胆汁酸和植物雌激素等。在本研究中，我们比较了依据冠状动脉狭窄程度分类的三组受试者的肠道菌群的结构。结果表明，肠道菌群结构随着CAD的进展而变化，某几个菌群可以独立预测CAD风险。此外，我们还验证了先前关于肠道菌群随CVD发生改变的研究报道。二、材料和方法（一）研究对象从2015年4月1日至2015年6月30日，本研究共连续地纳入了381名被怀疑可能患有CAD的患者。根据以下标准，这381名患者中有273人被排除：胃肠道溃疡、炎症性肠病（克罗恩病或溃疡性结肠炎）、乙肝或肝硬化、癌症、器官衰竭和其他病史；一个月内可能服用过益生菌（包括发酵乳制品，如酸奶）或益生元；最近一个月内接受过抗生素、抗酸剂、类固醇或消炎药（阿司匹林除外）的治疗；最近一个月内出现过便秘或腹泻；在过去六个月内接受过免疫抑制剂或生物制剂治疗。筛选后，108名患者接受了冠状动脉造影，最终共有78名粪便样本合格的患者被纳入研究。78名符合条件的受试者被分为三组：无冠状动脉狭窄（Ctrl组）、冠状动脉有狭窄且狭窄程度小于50%（1.T50组）、冠状动脉狭窄程度大于50%（GT50组）的受试者。GT50的受试者被定义为CAD患者。所有受试者均提供了书面知情同意书。复旦大学附属中山医院的机构审查委员会批准了所有的研究方案（IRB#327）。空腹血糖、血脂、酶活性、胆汁酸、尿素等均在雅培ARCHlTEeT平台（美国雅培诊断公司）检测。（二）样本采集、DNA提取、16S核糖体RNA基因测序和聚类分析获取住院患者的新鲜粪便样本（每份约0.2g）,在液氮中快速冷冻，后转移至-80°C下保存。使用试剂盒QlAamPDNAStoOlMiniKit（QIAGEN,美国），按照制造商的说明从粪便中分离细菌DNAo使用引物F357+GC/R518扩增16S核糖体RNA（rRNA）基因V4高变异区。聚合酶链反应（PCR）产物用AgenCOUrtAMPurebead（BeckmanCoulter,美国）进行纯化。使用少量（50ng）纯化DNA与IOnPlUSFragment1.ibraryKit（1.ifeTechnologies,美国）构建条形码文库。一个特定样品的"DNA分子标签（条形码）是一条可特异性识别原始模板分子的14个碱基的半随机序列。条形码文库中的DNA浓度用QubitTMdsDNAHS检测试剂盒（ThermoFisherScientificInc.,美国）检测。每次检测时文库被稀释到26pmol1.1以制备模板。使用IonOneTouch200TemplateKitv2（1.ifeTechnologies,美国）乳化PCR。扩增子文库的测序在318个芯片上使用IOnTorrentTM个人基因组机器（PGMTM）系统和IonPGM测序200试剂盒（1.ifeTechnologies,美国）进行。测序后，各序列读数由PGM软件过滤，去除低质量和多克隆序列。经过修剪和过滤，所有PGM质量合格的数据被导出为FASTQ文件。长度在150-220个碱基对、平均质量分数在20以上的序列被在线比对到可操作的序列中。然后用高识别度的集群数据库（CD-HIT）,将长度在150220个碱基对的序列同操作分类单位（OTU）进行在线比对。使用核糖体数据库项目（RDP）分类器对OTU进行分类，自举阈值为50%。所有程序都符合人类实验负责委员会（机构和国家）的伦理标准。本研究获得了所有纳入患者的知情同意。（三）统计分析如前所述，按照公式计算出OTU的生物多样性和丰富性。分类变量用百分数表示，不同组间用2检验进行比较。其他大多数分析采用t检验来比较不同组间的均值差异，除非另有说明。使用统计软件包SPSS（IU）.1版）建立多变量logistic回归模型，计算出丰度高于中位数与低于中位数的每个类群的CAD患病率的比值比（OR）及95%置信区间（95%CI）。模型中对传统的个人心脏危险因素或Framingham风险评分及肾功能进行了调整。通过HOSmer-1.emeShoW拟合度检验和SPSS的受试者工作特征（RoC）曲线下的面积来评估最终多变量二元logistic回归分析的总体预测价值和判别能力。使用R软件（3.6.2版）的ggplot2软件包绘制菌群在门、纲、属级别的相对丰度。使用单向Kruskal-Wallis方差分析（ANOVA）比较三种CAD表型之间的Chaol指数、Shannon指数、SimPSOn指数和均匀度指数的差异。使用R软件WiICoXon秩和检验比较两组之间的菌群相对丰度的区别。使用MetaboAnalySt进行主成分分析（PCA）和部分最小平方判别分析（P1.SDA）oB多样性由Bray-CUrtiS异质性与方差分析（Permanova）确定，以检验三组之间的菌群结构差异。使用MicrobiomeAnalyst根据Bray-Curtis异质性定义的多样性，采用Ward聚类聚集法进行层次聚类树状图的制作。使用R软件中的PcaMethod和pls软件包分别计算PCA的预测良好性（Q2）和拟合良好性（R2）。对于所有的统计检验，以p<0.05为差异具有统计学意义。三、结果（一）基线情况Ctrk1.T50和GT50三组的平均年龄分别为（61.4±7.5）岁、（60.6±10.8）岁和（61.7±9.0）岁，男性比例分别为68.4%、64.3%和84.4%（表1）。与1.T50组相比，GT50组的低密度脂蛋白胆固醇（IOWdensitylipoproteincholesterol,1.D1.-O明显降低。甘油三酯（EgIycerideJG）水平是动脉粥样硬化性心血管疾病的危险因素，本研究中观察到血浆TG水平随着动脉粥样硬化的进展而升高。糖尿病(diabetesmellitus,DM)是CAD的危险因素，本研究中DM诊断标准为空腹血糖大于7.0mmolH或有DM疾病史。在本研究队列中，尽管三组之间的空腹血糖没有明显差异，但我们观察到1.T50组和GT50组的DM患病率明显低于Ctrl组。GT5O组的高血压(HBP)患病率明显低于Ctrl组。三组间其他参数没有明显差异。表1受试者基线特征及实验室检测结果VariablesCtrl1.T50GT50(n=19)(n=14)(n=45)Age(year)61.4±7.560.6±10.861.7±9.0Sex(male%)68.464.384.4BMl24.2±4.323.4±3.424.7±2.4DM(%)47.414.3a15.6bHBP(%)78.957.144.4a1.eukocyte(×1091.,)7.8±3.86.1±2.37.0±2.5TC(mmol1.-1)4.1±0.84.5±1.23.8±1.01.D1.-C(mmol1.1)2.3±0.72.5±0.91.9±0.8cHD1.-C(mmol1.-1)1.3±0.41.3±0.31.2±0.4TG(mmol1.1)1.2±0.81.8±1.52.0±1.7aApoAl(g1.1)1.5±0.21.5±0.31.5±0.4ApoB(g1.,)0.8±0.20.8±0.30.7±0.2ApoE(mg1.1)38.5±13.040.5±13.837.1±18.51.P（八）(mg1.1)367.6±392.3264.9±362.0312.2±356.0Hb(g1.1)134.6±19.0135.7±15.4138.3±12.4Albumin(g-1.1)38.1±2.239.2±3.441.6±5.8A1.T(U1.')24.9±26.924.9±24.631.3±21.2AST(U1.)65.6±142.820.9±7.528.3±14.3Glycosylatedhemoglobin7.2±2.45.9±0.86.1±0.6(%)Alkalinephosphatase57.4±13.860.3±19.665.8±26.3(U1.l)Bilirubin(ngm1.1)15.9±17.410.4±4.113.0±8.7Bileacid(mmol1.,)4.6±3.44.2±2.24.1±3.0Urea(mmol1.,)6.5±3.25.9±3.04.9±1.8eGFR(m1.min1(1.73m2)-1)79.9±15.184.1±12.885.3±15.8Uricacid(mmol1.,)314.6±113.9380.7±165.5326.3±78.2Glucose(mmol1.1)6.3(5.2-7.4)5.3(5.1-6.1)5.7(5.0-6.7)Na*(mmol1.1)141.7±5.3141.6±3.2141.7±1.9K+(mmol1.1)4.0±0.54.1±0.23.9±0.6Cl(mmoI1.1)100.9±5.6103.7±3.9103.0±2.9ap<0.05vsCtrlgroup;bp<0.01vsCtrlgroup;cp<0.05vs1.TSOgroup.BMI:bodymassindex;DM:diabetesmellitus;HBP:highbloodpressure;TC:totalcholesterol;1.D1.-C:lowdensitylipoproteincholesterol;HD1.-C:highdensitylipoprotei