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圆形精子注射技术应用研究进展2024摘要圆形精子是成熟精子的前体细胞，具有单倍体的遗传特性，通过卵胞质内圆形精子注射(roundspermatidinjection,Rc)SI)技术可以使卵母细胞受精并发育成胎儿。1996年，第一例通过ROSI技术出生的婴儿诞生,但临床应用一直在成功与失败中反复交替。至今，ROSl技术尚未广泛应用于临床，主要原因在于ROSI技术出生效率低，且出生婴儿的安全性未得到充分验证。ROSI技术在解决部分非梗阻性无精子症患者生育生物学后代的问题上展现出广阔的应用前景。本文对ROSI技术的应用研究进展进行综述，以期更全面系统地认识ROSl技术,推动其在临床更高效、更安全地应用。无精子症是指在射出的精液中离心后也未能发现成熟精子，可分为梗阻性无精子症(obstructiveazoospermia,OA)和非梗阻性无精子症(non-obstructiveazoospermia,NOA)10OA和部分NOA患者通过睾丸穿刺活检等方式可以找到成熟精子2,然后通过卵胞质内单精子注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSl)技术获得生物学后代3然而超过60%的NoA患者即使行显微取精术也找不到成熟精子，无法通过ICSI技术获得生物学后代。在这些无法找到成熟精子的NOA患者中，约30%能够找到与成熟精子一样的由单倍体遗传组成的精子前体细胞，即圆形精子4,通过卵胞质内圆形精子注射(roundspermatidinjection,ROSI)技术可以解决此类患者的受精问题，获得生物学后代5o但是，ROSI技术存在出生效率低下以及后代安全性未得到充分评估等问题,因此ROSI技术一直被美国生殖医学会归类为实验性技术(6,至今未在临床广泛应用。据不完全统计,全世界目前仅有不到200例ROSI婴儿出生，中国尚无出生ROSI婴儿的报道7o现对ROSI技术应用的研究进展作一综述。一.ROSI动物模型应用研究1.小鼠ROSI研究小鼠是ROSI实验研究最早成功的动物模型。1994年，Ogura等8报道通过电融合的方式使圆形精子与卵母细胞受精，并成功诞生子代小鼠。1995年，Kimura和Yanagimachi9首次报道通过ROSl技术出生的小鼠,其受精率为77%,活产率为28.2%,该研究表明圆形精子不能激活卵母细胞,需通过电刺激来辅助卵母细胞激活(assistedoocyteactivation,AOA2004年Kishigami等10的研究显示注射圆形精子与注射成熟精子都具有最佳受精的时间窗，随着卵母细胞激活时间的延长，ROSI胚胎的发育能力逐渐下降。2011年，OgonUki等11研究了在没有AOA时，注射圆形精子后小鼠卵母细胞受精的能力，结果显示，注射冷冻-解冻后圆形精子可以使部分卵母细胞受精，并发育成2-细胞胚胎，这表明使用冻融圆形精子可提高激活卵母细胞的能力，但具体机制尚不清楚。2018年Chen等12的研究显示，不同时期的小鼠ROSI后,胚胎发育潜能不同，12期的囊胚率为11.1%,78期的囊胚率为73.8%o2.其他动物ROSI研究：小鼠ROSI应用研究已趋于成熟，但在其他物种中仅见少量报道。1994年报道了第一例ROSI受精的兔卵母细胞13;2009年通过优化AOA方案，出生了第f(JROSI兔子1402017年，Ogonuki等15用未性成熟的成猴圆形精子进行ROSI研究，观察到晚期圆形精子具有激活卵母细胞的能力，将冻融后的晚期圆形精子注入卵母细胞内，胚胎可以发育至8-细胞时期;2019年报道了第一例通过注射延长型圆形精子出生的戡猴16O在猪、牛、羊等家畜中未有ROSI出生动物的报道1701999年，Kim等18分别将猪圆形精子和圆形精子细胞核注射到卵母细胞内得到了70%和75%的受精率，第8天的囊胚率分别为30%和35%,并且囊胚的细胞数没有差异；2004年Choi等19研究了三种激活方案对猪ROSI后受精率和早期胚胎发育的影响，使用最佳激活方案,获得了88%的受精率，79%的卵裂率和20%的囊胚率。2006年Ock等20关于牛ROSI的研究，获得了13.1%的囊胚率。国内1.iu等212012年关于羊ROSI的研究表明在最佳激活条件下囊胚率可达39.7%o二.ROSI临床应用研究1.人ROSI首次成功实践动物ROSI的研究表明其在方法学上是可行的，ROSI的临床应用研究经历了长时间的探索。1995年，Vanderzwalmen等22首次报道了ROSI可以使人卵母细胞正常受精。Tesarik等23在1996年首次报道了通过ROSI技术实现人类婴儿的诞生,该研究中共纳入7对行ROSI治疗的夫妻，注射了39枚卵母细胞，其中6对夫妻获得了14枚受精胚胎,其中12枚胚胎移植后，2对夫妻获得了活产胎儿，该研究强调使用完整RoSl的重要性避免仅注射圆形精子细胞核表1%表I帆形桶/注射临床应川发17数据总结时间作者国家注射数受精致蹙精率(%)移植胚胎数活产胎儿数1995年VaiKlrrzMalnirn等二'比利时4375.00未报遒未报道1996年Tewrikl,2,1法国391435.901221996年Mim*oIr等埃及1054038.0932I1997年Van<lr*zMal11Man等比利时2605721.927I1997年Anlinori等蠢大利1357555.5556推线妊&1997年Yamanaltfi等日本493469.3824O1997年AnlinWi等意大利15746.666维续妊修1997年Amrrll,法国54412923.71未报道O1998年Kahraman等±4K1995125.6232O1998年Kitrak等C以色列37IO27.024I1998年BrrnllIM«11等回西班牙7342.853I1999年(Uuuxawi3Jn'约旦57412621.9540O1999年Cianamli等"意大利5240.211999年AivHwMmi等M»a49918.369O2000年IJrlnm等“，以色列1788145.5()48O2000年BaIatNin等,土耳其35620056.17O/2000年TzikM法M26)453.85O/2000年N,中IHfi;港2074823.1911O2001年Vkthn等士4其601728.335O2002年1.muin等"，土耳其I0214)424.9016O22年Swa等Itt葡才1262015.879O2002年SeMlM等"前萄牙26934.62O/22年KMiIi等闻伊朗42921.426O2003年等刈土耳其36IS41.66IOO2004年Benkhalifa等川土耳其1435135.6611O2015年GfMIWMli等5印度21IO47.624O2015年Tenalui等1.日本73443759.54208142018年Tanaka等"日本14324813256.77388290注:注射数包括新解和冷冻4T冻阳杉精夕注射总数;移赫胚胎数包括新斛和冷冻-解冻胚龄移减总数;推续妊&&示文聿发&时候原文的描述;“广示移植胚舱数为O,不涉及活产数2.人ROSI成功与失败反复交替"9972004年间世界范围内广泛开展了ROSI技术的临床实践，大部分以失败告终，零星报道了几例活产胎儿50o1998年，Barak等31研究了13对NOA不育夫妻的ROSI结局，注射37枚卵母细胞,受精率为27.02%,活产1例胎儿，活产率为4.3%o1999年，Gianaroli等34报道了1例用冻融的圆形精子行ROSI后结局，注射5枚卵母细胞，形成2枚受精胚胎,移植后活产1例胎儿。2020年Gross等51和2021年Tekayev等7对ROSI的临床应用进行了总结，我们结合最新的文献报道，重新整理了关于ROSI技术临床应用相关发育数据的总结，详见表1。3.人ROSI研究新篇章：20052014年间，ROSI的临床应用研究没有新进展。直到2015年Tanaka等48报道了通过ROSI出生14例婴儿的案例，极大地鼓舞了ROSl临床应用的信心。该研究中所有患者均行显微取精术，生精小管被酶裂解后冷冻，行ROSI前解冻；解冻后用微分干涉相差显微镜通过大小和形态对圆形精子进行初步筛选，并进行了荧光原位杂交和染色体核型鉴定在ROSI前IOmin采用电刺激行卵母细胞AOA。730对NOA患者夫妻进行163个移植周期,14对夫妻妊娠活产，新生儿的染色体核型和体质量均正常。安全性是任何ART都需要考虑的重要话题之T52o根据2018年Tanaka等49发表的关于ROSI胎儿2年内随访的最新研究，90例ROSI子代中有3例观察到了先天性畸形，1例室间隔缺损自行愈合，其他畸形1例唇裂和1例脐疝均通过手术成功矫正，无任何并发症。在朱海波等53关于小鼠ROSI胎鼠安全性的研究上，表明ROSI出生小鼠在体质量、性别比、生长速率和自然繁育能力上与ICSI是没有差异和安全的，这与Tanaka等关于人ROSI安全性研究的结果是一致的。Zhu等54对小鼠胚胎发育11.5d的ROSI胎鼠和胎盘的转录组和DNA甲基化图谱与ICSI组、自然受孕组进行了对比，一些异常激活的重复DNA序列和一些差异表达基因值得关注。2021年Hanson等55关于RoSl临床应用的荟萃分析结果表明ROSI的受精率为38.7%(95%CI:1.5%46.3%),临床妊娠率为3.7%(95%CI:3.2%4.4%),累积临床妊娠率为13.4%(95%CI:6.8%19.1%),累积活产率为8.1%(95%CI:6.1%-14.4%1结果表明，ROSl技术对于部分NOA患者是一种可行方案，可以实现临床妊娠和活产，但其出生率远低于注射成熟精子。三.结语与展望ROSl技术可以解决部分NOA患者生育生物学后代的需求,虽存在出生效率低下等问题，但仍展现出强大的魅力。此外，最近的临床实践也取得了巨大突破，对ROSI技术出生后代2年内的随访也表明婴儿是健康的。笔者认为，应该鼓励RoSI临床应用的进一步研究，关注这一不断发展的新领域。综上所述，ROSI技术具有广阔的应用前景，但仍需更多深入系统地研究，以保证RoSl技术更高效、更安全地应用于临床。